農(nóng)田土壤中鄰苯二甲酸酯(Phthalic acid ester,PAEs)的污染狀況日趨嚴(yán)重,直接影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全,嚴(yán)重危害人體健康。課題組前期對(duì)篩選獲得的高/低累積PAEs菜心(Brassica parachinensis L)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和蛋白組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白(nsLTP)基因在菜心高、低累積PAEs過程中差異表達(dá)十分顯著。因此,為探討nsLTP菜心在高/低累積PAEs差異特性形成中的作用,本研究通過RACE克隆獲得了菜心nsLTP基因全長(zhǎng)并對(duì)其進(jìn)行序列分析,采用原核表達(dá),亞細(xì)胞定位和分子模擬等實(shí)驗(yàn)手段研究其分子生理功能,為揭示不同基因型菜心高/低累積PAEs性狀形成的分子生物學(xué)機(jī)制提供基礎(chǔ)。本論文取得的主要研究結(jié)果如下:(1)本研究以菜心轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),經(jīng)過RACE克隆獲得了菜心nsLTP基因全長(zhǎng)。該基因全長(zhǎng)587 bp,開放閱讀框(ORF)長(zhǎng)297 bp。共編碼97個(gè)氨基酸,蛋白分子量為10.36 KDa,根據(jù)蛋白質(zhì)分子量分類,其屬于nsLTP I型蛋白。通過基因序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)與油菜(Brasscia nupus)nsTLP基因同源性最高,同源性高達(dá)97%,蛋白質(zhì)多重比對(duì)以及進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn),與蕪菁(Brasscia rapa)和油菜(Brasscia napus)差異最小,與芥藍(lán)(Camelina sativa)差異最大。通過對(duì)蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),該基因編碼的蛋白質(zhì)N端有一段29個(gè)氨基酸大小的信號(hào)肽,且具有與信號(hào)肽序列重疊的跨膜結(jié)構(gòu),對(duì)應(yīng)的氨基酸序列疏水性明顯。對(duì)菜心nsLTP蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),nsLTP基因編碼蛋白具有8個(gè)半胱氨酸組成4對(duì)二硫鍵而形成的疏水腔空穴。(2)成功構(gòu)建pET-32a-nsLTP原核表達(dá)載體,在IPTG誘導(dǎo)下可在短時(shí)間內(nèi)(3h)獲得了大量重組蛋白。該蛋白為可溶性蛋白,低溫及提高誘導(dǎo)劑濃度有利于重組蛋白可溶性表達(dá)。通過His標(biāo)簽純化獲得了重組蛋白,Western Blot驗(yàn)證顯示獲得的蛋白為目的重組蛋白。nsLTP基因原核表達(dá)及蛋白純化為進(jìn)一步研究nsLTP蛋白功能提供了基礎(chǔ)。(3)成功構(gòu)建了亞細(xì)胞定位載體pBI-121-GFP-nsLTP,并轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞,侵染洋蔥表皮細(xì)胞,通過激光共聚焦顯微鏡觀察pBI-121-GFP-nsLTP融合蛋白綠色熒光信號(hào)在細(xì)胞中的分布情況。結(jié)果表明,GFP-nsLTP融合蛋白綠色熒光信號(hào)分布在細(xì)胞壁上,細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜中均未顯示。為進(jìn)一步確認(rèn)融合蛋白熒光信號(hào)的分布,利用蔗糖溶液將洋蔥細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)壁分離,結(jié)果發(fā)現(xiàn),原生質(zhì)體明顯皺縮,細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中無熒光信號(hào),而細(xì)胞壁上發(fā)現(xiàn)了明顯熒光信號(hào),說明菜心中nsLTP蛋白定位在細(xì)胞壁上,與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。(4)利用分子模擬對(duì)DBP和nsLTP蛋白結(jié)合模擬分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),DBP能緊密結(jié)合于nsLTP蛋白的H3和H5 α螺旋形成疏水性口袋中,并與H3 α螺旋上的半胱氨酸(Cys-37)通過氫鍵結(jié)合在一起,形成了 Cys-37:HN:DBP結(jié)構(gòu),鍵長(zhǎng)為1.784 A。DBP分子被nsLTP蛋白分子中的Cys-65、Leu-36、Asn-64、Pro-63、Pro-34、Ser-62、Ala-61、Lys-33等氨基酯酸殘基環(huán)繞。由于配體具有可旋轉(zhuǎn)的原子,分子對(duì)接中的扭轉(zhuǎn)能(Torsional Energy)為2.98 kcal/mol,配體和蛋白二者相互作用的分子間能量(Inermol Energy)為-7.44 kcal/mol,因此計(jì)算得到二者的結(jié)合能量(Binding Energy)為-4.46 kcal/mol(結(jié)合能=分子間能量+扭轉(zhuǎn)能)。nsLTP蛋白能與DBP結(jié)合形成穩(wěn)定復(fù)合物,在菜心吸收累積PAEs過程中具有重要作用。
【學(xué)位單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S634.5;X592
【部分圖文】：

合邋Ｃ－Ｘｎ－Ｃ－Ｘｎ－ＣＣ－Ｘｎ－ＣＸＣ－Ｘｎ－Ｃ－Ｘｎ－Ｃ邋形成了穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)［６３］。逡逑ｎｓＬＴＰ邋Ｉ和ｎｓＬＴＰＩＩ兩種類型蛋白內(nèi)的４對(duì)二硫鍵位置高度保守，但在二硫逡逑鍵配對(duì)的模式有所區(qū)別。如圖１邋（Ａ）所示，在ｎｓＬＴＰｌ家族中，Ｃｙｓ３與Ｃｙｓ５０逡逑配對(duì)，而在１＾�。�？１１中，S8NB８３與迤V８３５配對(duì)。此外，由圖１（：８）可以看出兩種逡逑蛋白的空間結(jié)構(gòu)也有所不同。ｎｓＬＴＰ邋Ｉ蛋白中的－ＣＸＣ－ｍｏｔｉｆ被埋在分子內(nèi)部，逡逑其中Ｘ通常為親水性的天冬酰胺（Ａｓｎ）殘基；而ｎｓＬＴＰｌＩ蛋白中的－ＣＸＣ－ｍｏｔｉｆ逡逑則暴露在蛋白分子表面，其中Ｘ—般為疏水性的苯丙氨酸（Ｐｈｅ）殘基。ｎｓＬＴＰ逡逑Ｉ和ｎｓＬＴＰｌＩ分子中均含有能結(jié)合脂質(zhì)的疏水腔，但二者蛋白的疏水腔凹穴也逡逑有些差別，ｎｓＬＴＰ邋Ｉ蛋白疏水腔空穴較大，而ｎｓＬＴＰ邋ＩＩ蛋白分子中的凹穴比逡逑ｎｓＬＴＰ邋Ｉ的小，但柔性更好，因此，ｎｓＬＴＰＩＩ分子能結(jié)合ｎｓＬＴＰ邋Ｉ不能結(jié)合的甾逡逑醇等長(zhǎng)鏈分子［６４￣６６］。逡逑６逡逑

２．２結(jié)果與分析逡逑２．２．１總ＲＮＡ分析逡逑ＲＮＡ的質(zhì)量是ＲＡＣＥ全長(zhǎng)克隆的成功關(guān)鍵從圖２．１可以清晰看到２８Ｓ逡逑ｒＲＮＡ和１８ｓｒＲＮＡ完整，經(jīng)過微f埡慫嵋羌觳猓希模玻叮埃哄澹希模玻福拔玻�，提取的伭x希遙危鏈慷冉細(xì)擼蔲埥蝦�，可用来进行＿b粒茫湃た寺∈笛椋掊義稀觶籗茫懾危玻埃埃板義希保埃埃板義希玻櫻渝蜽＾邐１逡逑１００逡逑圖２．１菜心總ＲＮＡ邐圖２．２邋５，邋ＲＡＣＥ邋產(chǎn)物逡逑Ｆｉｇ邋２．１邋Ｔｈｅ邋ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ＬＢ邐Ｆｉｇ邋２．２邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋５’邋ＲＡＣＥ逡逑２．２．２邋ｎｓＬＴＰ基因全長(zhǎng)克隆逡逑根據(jù)ＬＢ菜心轉(zhuǎn)錄組獲得的ｎｓＬＴＰ基國(guó)片段，設(shè)計(jì)５’ＲＡＣＥ特異性引物逡逑ＧＳＰ１，與試劑盒自帶通用引物（ＵＰＭ）進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，克隆得到４６０ｂｐ的單逡逑一條帶（圖２．２）。將５’ＲＡＣＥ全長(zhǎng)克隆產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與ＬＢ高通量測(cè)序序列拼逡逑接，去除重復(fù)序列得到目的基因ｃＤＮＡ序列，獲得菜心ｎｓＬＴＰ基因全長(zhǎng)序列共逡逑５８７ｂｐ，并上傳至ＮＣＢＩ邋（登錄號(hào)ＭＨ１２７９１６）。植物的ｎｓＬＴＰ墓：因從１９７５年被逡逑發(fā)現(xiàn)并命名至今

逡逑２．２．３邐ｎｓＬＴＰ基因序列分析逡逑經(jīng)分析菜心ｎｓＬＴＰ基因編碼蛋白區(qū)域長(zhǎng)２９４ｂｐ邋（圖２＿３），共編碼９７個(gè)氨逡逑基酸，分子f堅(jiān)嘉

本文編號(hào)：2833307