目前,由于植被利用及人為活動(dòng)造成的土壤重金屬污染日益嚴(yán)重,植物修復(fù)是改善重金屬污染土壤環(huán)境的新興技術(shù)。銅既是土壤重金屬污染的主要污染物之一,又是植物維持正常生命活動(dòng)所需的微量元素。為了適應(yīng)環(huán)境中的銅水平,植物已經(jīng)形成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以維持細(xì)胞銅穩(wěn)態(tài),銅伴侶蛋白是實(shí)現(xiàn)此機(jī)制的重要參與者。本研究在課題組前期工作的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了小黑楊(Populus simonii×us nigra)銅伴侶蛋白基因PnCCH5、PnCCH10、PnCCH19的植物表達(dá)載體。利用構(gòu)建的PnCCH10基因的表達(dá)載體,通過蘸花法遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥野生型植株及cch突變體植株;通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法遺傳轉(zhuǎn)化小黑楊,分別獲得了轉(zhuǎn)PnCCH10基因的擬南芥和小黑楊植株,并進(jìn)行了相關(guān)分子生物學(xué)和生理指標(biāo)鑒定。主要研究結(jié)果如下:(1)利用已經(jīng)克隆的小黑楊PnCCH5(MF977407.1)、PnCCH10(MF977410.1)和PnCCH19(MF977413.1)基因,通過酶切連接法構(gòu)建了擬南芥過量表達(dá)載體pCAMBIA1302-PnCCHs,電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101后獲得了含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株。同時(shí),構(gòu)建了 PnCCH5、PnCCH10及PnCCH19基因的小黑楊過量表達(dá)載體pROKII-PnCCHs,電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EHA105后獲得了含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株。(2)利用構(gòu)建的PnCCH10基因的擬南芥過量表達(dá)載體,通過蘸花法遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥野生型及cch突變體植株。利用潮霉素進(jìn)行篩選并獲得T2代植株。提取兩種類型T2代轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA,通過PCR方法鑒定后獲得了 9個(gè)PnCCH10-WT轉(zhuǎn)基因株系和10個(gè)PnCCH10-cch轉(zhuǎn)基因株系。收取鑒定后的轉(zhuǎn)基因植株純合種子并保存。(3)利用構(gòu)建的PnCCH10基因的小黑楊過量表達(dá)載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法遺傳轉(zhuǎn)化小黑楊野生型植株。利用含有卡那霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選后獲得陽性植株。提取陽性轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA,利用特異性檢測引物進(jìn)行PCR鑒定,獲得了 16個(gè)PnCCH10轉(zhuǎn)基因小黑楊株系。利用qRT-PCR方法鑒定轉(zhuǎn)基因株系中PnCCH10基因的表達(dá)情況,挑選出5個(gè)PnCCH10基因高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行生理指標(biāo)測定。(4)利用含有正常濃度銅離子(0.5 μmol/L)和高濃度銅離子(10 μmol/L)的改良1/2霍格蘭德營養(yǎng)液水培處理小黑楊野生型和轉(zhuǎn)基因株系幼苗7 d。測定處理植株的丙二醛(MDA)含量,同時(shí)測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)酶活等生理指標(biāo)。結(jié)果顯示,正常濃度銅離子處理?xiàng)l件下,與野生型對照植株相比,2和13號轉(zhuǎn)基因株系葉片MDA含量顯著降低,5號株系根MDA含量顯著升高;各轉(zhuǎn)基因株系葉片和根SOD酶活顯著升高;3、5、7、13號株系葉片和2、5、13號株系根的POD酶活顯著降低;13號株系葉片和3、5、7、13號轉(zhuǎn)基因株系根CAT酶活顯著升高。過量銅脅迫處理后,與野生型植株相比,各PnCCH10過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系MDA含量和SOD酶活無顯著變化;除了7號株系根POD酶活無顯著差異之外,其余各轉(zhuǎn)基因株系葉片和根POD酶活均顯著下降;除了 5號轉(zhuǎn)基因株系葉片CAT酶活無顯著差異之外,各轉(zhuǎn)基因株系根CAT酶活顯著降低,葉片CAT酶活顯著升高。這些研究結(jié)果為進(jìn)一步鑒定小黑楊PnCCH10蛋白的功能、豐富銅伴侶蛋白CCH在維持楊樹細(xì)胞銅穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮的作用奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ),為培育重金屬耐受植物來修復(fù)土壤污染提供材料依據(jù)。
【學(xué)位單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：X53;X173;Q943.2
【部分圖文】：

以稀釋邋５０邋倍的尸７７ＣＣ／／５－ｐＥＡＳＹ、／＾ＣＣ／／／（？－ｐＥＡＳＹ、尸／？ＣＣ７／／９－ｐＥＡＳＹ邋克隆質(zhì)粒逡逑為模板，使用含有Ｗｃｏ邋Ｉ和５＾邋Ｉ的擬南芥表達(dá)載體引物進(jìn)行ＰＣＲ，獲得目的條帶后進(jìn)逡逑行ＰＣＲ產(chǎn)物回收純化。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示（圖２－１），小黑楊Ｐ？ＣＣ／／５、逡逑ＰｔｔＣＣ／／川和基因的目的擴(kuò)增條帶長度分別為４５３、４９２、５３７邋ｂｐ，條帶大小符逡逑合預(yù)期且條帶單一，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。逡逑Ｍ邐１邐２邐３逡逑—逡逑圖２－１構(gòu)建擬南芥表達(dá)載體目的基因的ＰＣＲ純化產(chǎn)物逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；邋１：邐基因；２：乃７ＣＣ／／７０邋基因；３：邋Ｐ／７ＣＣ／／７９邋基因。逡逑以稀釋邋５０邋倍的邋Ｐ？ＣＣ／／５－ｐＥＡＳＹ、尸ｗＣＣＺ／ｉＯ－ｐＥＡＳＹ、Ｐ？ＣＣ７／／９－ｐＥＡＳＹ邋克隆質(zhì)粒逡逑－１２－逡逑

逑為模板，使用含有沿＾１和你酶切位點(diǎn)的小黑楊表達(dá)載體引物進(jìn)行ＰＣＲ，獲得目的逡逑條帶后進(jìn)行ＰＣＲ產(chǎn)物回收純化。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示（圖２－２），小黑楊逡逑尸》ＣＣ／／５、Ｐ？ＣＣ／／７０和尸ｚ？ＣＣ／／／９基因的目的擴(kuò)增條帶大小符合預(yù)期。逡逑５００邋ｂｐ逡逑忍＇邐ｒ邐．逡逑圖２－２構(gòu)建小黑楊達(dá)載體目的基因的ＰＣＲ純化產(chǎn)物逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；邋１：尸／７ＣＣ／／５邋基因；２：尸《0＾／７０邋基因；３：邋ＡＣＣ／Ｚ／Ｐ邋基因。逡逑２．３．２乃ｉＣＣＷｓ基因及質(zhì)粒雙酶切逡逑在含有Ｋａｎ的ＬＢ固體培養(yǎng)基上劃線載體菌種，挑取單菌落，３７°Ｃ過夜擴(kuò)大培養(yǎng)。逡逑利用質(zhì)粒小提試劑盒提�。校茫粒停拢桑粒保常埃布埃穑遥希耍桑少|(zhì)粒。結(jié)果如圖２－３所示。ｐＲＯＫＩＩ逡逑和ｐＣＡＭＢＩＡ〗３０２質(zhì)粒提取效果良好，可以用于雙酶切反應(yīng)。逡逑Ｍ邐１邐Ｍ邐２逡逑１００００邋ｂｐ邋Ｉ邋１邋＇逡逑■■逡逑圖邋２－３邋ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２邋和邋ｐＲＯＫＩＩ邋載體質(zhì)粒逡逑Ｍ：邋ＤＬ１５０００Ｍａｒｋｅｒ；邋１：邋ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２邋載體質(zhì)粒；２：邋ｐＲＯＫＩＩ邋載體質(zhì)粒。逡逑使用限制性內(nèi)切酶＃ｃｏ邋Ｉ和Ｓｐｅ丨分別雙酶切ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２質(zhì)粒及含有酶切位點(diǎn)的逡逑／＾ＣＣ／／５、尸《ＣＯ／／０、Ａ？ＣＣ７／／９基因的ＰＣＲ純化產(chǎn)物。瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示逡逑－１３－逡逑

圖２－４邋ＰＣＡＭＢＩＡ１３０２質(zhì)粒的酶切結(jié)果邐圖２－５邋ＰｎＣＣ歷基因的酶切結(jié)果逡逑Ｍ：邋ＤＬ１５０００邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１：質(zhì)粒酶切前；邐Ｍ：邋ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；邋１：尸《０：奶基因；２：逡逑２：質(zhì)粒酶切后。邐辦《：／／５基因酶切產(chǎn)物；３：邋ＰｎＣＣＺ／ｉＯ基因；４：逡逑戶；７0：／／／０基因酶切產(chǎn)物；５：邋ＰｒｔＣＣ７／／９基因；逡逑６：邋Ｐ？ＣＣ／／／９基因酶切產(chǎn)物。逡逑使用限制性內(nèi)切酶沿ｗ邋Ｉ和Ｉ分別雙酶切ｐＲＯＫＩＩ質(zhì)粒及含有酶切位點(diǎn)的逡逑／＾＜Ｘ７／＿５、乃７ＣＣn,、／＾ＣＯ／７９基因的ＰＣＲ純化產(chǎn)物。瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示逡逑（圖２－６，２－７），ｐＲＯＫＩＩ質(zhì)粒雙酶切之后，目的條帶與ＳＣ構(gòu)型的原始質(zhì)粒存在位移逡逑差，由此表明，載體酶切成功。ＡＣＯ／５、＾ＣＣＺ／川、Ｐ？ＣＣ扣９基因的ＰＣＲ純化產(chǎn)物逡逑酶切后電泳遷移率與酶切之前無明顯差異。逡逑Ｍ邐１邐２邐Ｍ邋１邐２邐３邐４邐５邐６逡逑

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本文編號：2830969