熱休克蛋白70(Heat shock proteins 70,HSP70s)包括組成型表達(dá)的HSC70和誘導(dǎo)型表達(dá)的HSP70,是參與生物生命活動的重要分子。近江牡蠣(Crassostrea hongkongensis)是重要經(jīng)濟(jì)貝類,當(dāng)其受到污染物等脅迫因子作用時,其體內(nèi)的HSC70基因表達(dá)水平發(fā)生改變,其表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄因子的正負(fù)調(diào)控,但是目前還沒有關(guān)于其正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的報道。本文以近江牡蠣(C.hongkongensis)為實驗對象,采用DNA親和純化和蛋白質(zhì)譜檢測技術(shù)篩選出與ChHsc70基因啟動子有關(guān)聯(lián)的Gnaq蛋白。參照近江牡蠣近源物種太平洋牡蠣Gnaq的編碼區(qū)序列設(shè)計引物,以近江牡蠣的cDNA為模板,擴(kuò)增出近江牡蠣Gnaq基因的編碼區(qū)序列。通過RACE全長擴(kuò)增技術(shù)和蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模擬等技術(shù),確定了ChGnaq的cDNA全長序列和蛋白質(zhì)同源三維結(jié)構(gòu),通過RNAi技術(shù),體外過表達(dá)技術(shù)、qRT-PCR技術(shù)驗證了Gnaq對ChHsc70的調(diào)控作用。具體結(jié)果為:近江牡蠣ChGnaq基因全長cDNA為1476 bp,其中,5’端非編碼區(qū)長度為211 bp,3’端非編碼區(qū)長度為203 bp,開放閱讀框為1062 bp,編碼353個氨基酸。Gnaq蛋白質(zhì)包含GTPase和helical兩個區(qū)域;GTPase區(qū)域,是G蛋白中最為保守的區(qū)域,主要功能是作為GTP酶,參與GTP的水解,將GTP水解成GDP,同時這個區(qū)域也包含Gnaq蛋白與Gβγ和跨膜螺旋結(jié)構(gòu)受體、效應(yīng)分子相互結(jié)合的位點(diǎn)。ChGnaq基因三維結(jié)構(gòu)的N末端含有一個核定位信號序列和帶正電的突出的α螺旋。N末端可以將G蛋白定位于細(xì)胞核中,同時也是蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)與脂質(zhì)相互結(jié)合的位點(diǎn)。在ChGnaq mRNA被敲低的情況下,ChHsc70的mRNA水平下降,表明ChGnaq對ChHsc70的轉(zhuǎn)錄表達(dá)起正調(diào)控作用;在ChGnaq蛋白過表達(dá)情況下,ChHsc70啟動子下游的報告基因表達(dá)量極顯著升高,這也表明ChGnaq蛋白對ChHsc70的表達(dá)起正調(diào)控作用;熱激或污染物處理的近江牡蠣中ChGnaq和ChHsc70兩基因表達(dá)模式相似,均為先升高,達(dá)到峰值后,再回復(fù)到正常水,但是,也存在差異,一方面,ChGnaq出現(xiàn)顯著高表達(dá)的時間早于ChHsc70的顯著高表達(dá)時間,提示ChGnaq在ChHsc70顯著高表達(dá)中發(fā)揮作用。另一方面,ChGnaq對溫度刺激響應(yīng)的時間極短,對污染物的響應(yīng)時間長,ChGnaq對污染物的響應(yīng)具有偏好性,是合適的輔助污染預(yù)警分子,用ChHsc70對ChGnaq的相對表達(dá)比值能矯正溫度變化對污染預(yù)警分子ChHsc70指示污染發(fā)生的干擾,比值在4以上,是溫變引起,比值在3以下是污染發(fā)生。研究結(jié)果表明近江牡蠣ChGnaq對ChHsc70基因的轉(zhuǎn)錄起正調(diào)控作用,為完善近江牡蠣ChHsc70的表達(dá)調(diào)控機(jī)制具有重要意義。ChGnaq對污染物的響應(yīng)具有偏好性,是一個合適的輔助污染預(yù)警分子,可以矯正溫度變化對HSC70指示海洋環(huán)境污染狀況的影響,為建立海洋環(huán)境污染預(yù)警技術(shù)奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：X52;Q953
【部分圖文】：

圖 1.1 Gnaq 二級結(jié)構(gòu)的線性展示圖[72]Figure 1-1 Linear representation of secondary structure of Gnaq3.2 Gnaq 蛋白質(zhì)的功能G 蛋白耦聯(lián)型受體的信號傳遞過程包括：第 步受體同配體之間相互結(jié)合；第二步受體進(jìn) 步活化 G 蛋白；第с步 G 蛋白再進(jìn) 步激活或者抑制細(xì)胞中的效應(yīng)分子；第四步激活的效應(yīng)分子改變胞內(nèi)信使的含量和它的分布；第五步胞內(nèi)信使作用于細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的靶分子，進(jìn)而改變細(xì)胞的代謝過程以及基因表達(dá)等重要的生理功能。胞外信號被膜受體接受后，通過 Gnaq 蛋白耦合激活磷脂酶 PLCβ，將磷脂酰肌醇二磷酸PIP2分解為肌醇с磷酸 IP3和二酰甘油 DAG，產(chǎn)生出兩個胞內(nèi)信使，

暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文胞的分裂[85]等生命活動。Gnaq 信號通路可以通過 系列磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，從而磷酸化轉(zhuǎn)錄因子從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程，進(jìn)而參у 系列生命活動。Gnaq 信號通路通過激活я裂原活化蛋白激酶途徑激活轉(zhuǎn)錄因子 NF-kB[86]，以及 CREB（cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白）[87]，Egr-1[88]，AP-1[89]等。其中 CREB 是 類信號轉(zhuǎn)錄因子，被磷酸化后，可以誘導(dǎo)那些含有 cAMP 響應(yīng)元素（CRE）的增強(qiáng)子的調(diào)控結(jié)構(gòu)的基因的轉(zhuǎn)錄[90]。CREB 被各種生理刺激激活可以在許多重要的生物過程中發(fā)揮重要的作用[91]。Gnaq 通路通過活化 RhoGTPases 進(jìn) 步激活轉(zhuǎn)錄因子 SRF(血清反應(yīng)因子)及其心肌素相關(guān)的共激活因子[92; 93]。SRF 是已知的控制各種細(xì)胞功能，包括細(xì)胞生存，分化，增殖和遷移的 種轉(zhuǎn)錄因子[94]。而 AP-1， 類堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，在調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)和炎癥中起重要作用[95]。

圖 2.1 DNA-蛋白親和純化洗脫蛋白的 SDS-PAGE 電泳檢測Figure 2.1 SDS-PAGE electrophoresis of proteins isolated by DNA affinity purification注：第 泳道為 Marker，Control 為未處理對照組，Heat shock 為熱激處理組，CdCl2為氯化鎘處理，分子標(biāo)記的大小以 kDa 表示在左側(cè)。每組各有兩個濃度：200 mM 和 1 M。目標(biāo)蛋白質(zhì)條帶的位置用箭頭表示，大小在 40 kDa。3.2 質(zhì)譜檢測結(jié)果如圖 2.2 所示，經(jīng)過質(zhì)譜檢測后，得知該蛋白質(zhì)為 Gnaq 蛋白，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列у太平洋牡蠣 Gnaq 蛋白質(zhì)的氨基酸序列相似性達(dá)到 22%，因此篩選確定本實驗研究蛋白為 Gnaq 蛋白。

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本文編號：2821192