【摘要】：四溴雙酚A(TBBPA)是使用量最大的溴代阻燃劑之一,容易釋放到各種環(huán)境介質(zhì)中并造成污染。由于TBBPA具有一定的生物毒性和生物累積性,給生態(tài)系統(tǒng)和人類的健康安全帶來潛在威脅,因此針對(duì)其高效降解技術(shù)的研究備受關(guān)注。微生物修復(fù)是去除環(huán)境中有毒有害環(huán)境污染物的一種重要手段,其中,白腐真菌因其強(qiáng)大的酶系統(tǒng)在多種有機(jī)污染物的降解過程中發(fā)揮重要作用。目前關(guān)于白腐真菌去除TBBPA的研究主要集中于真菌所分泌的漆酶對(duì)TBBPA的降解路徑,而非真菌直接生物轉(zhuǎn)化TBBPA的機(jī)理,對(duì)真菌降解TBBPA的蛋白分子機(jī)制的研究甚少。鑒于此,本研究選用黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)作為實(shí)驗(yàn)菌株,開展對(duì)TBBPA的去除性能、降解途徑、解毒特性和蛋白質(zhì)水平的降解機(jī)制研究,此外,還初步考察了P.chrysosporium應(yīng)用于水/沉積物體系中TBBPA生物強(qiáng)化修復(fù)的可行性。本論文取得的主要研究結(jié)果如下:(1)P.chrysosporium對(duì)TBBPA的去除效果與多種環(huán)境因素有關(guān),通過單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定了TBBPA去除的最佳條件為:初始pH 4~5,葡萄糖濃度5 g/L,孢子液接種體積比為5%,TBBPA濃度5 mg/L。在最佳條件下反應(yīng)3 d后,TBBPA去除率可達(dá)97.7%。低濃度(5 mg/L)Cd~(2+)對(duì)TBBPA的去除沒有顯著影響,高濃度(≥20 mg/L)Cd~(2+)則顯著抑制P.chrysosporium對(duì)TBBPA的去除。外源添加細(xì)胞色素P450酶抑制劑可以顯著降低TBBPA的去除率,表明菌體細(xì)胞色素P450酶參與了TBBPA的降解過程。(2)利用LC-Q-TOF-MS/MS鑒定出7種TBBPA代謝產(chǎn)物,包括:四溴雙酚A葡萄糖苷、三溴雙酚A、三溴雙酚A葡萄糖苷、單羥基四溴雙酚A、4-(2-羥基-異丙基)-2,6-二溴苯酚、4-(2-甲氧基-異丙基)-2,6-二溴苯酚以及對(duì)羥基苯甲酸。發(fā)現(xiàn)除了脫溴途徑和氧化裂解途徑,真菌還能通過糖苷化和羥基化途徑轉(zhuǎn)化TBBPA。為明確P.chrysosporium對(duì)TBBPA的解毒特性,以HepG2為模式細(xì)胞,考察了不同濃度TBBPA及降解3 d的代謝混合物的細(xì)胞毒性效應(yīng),結(jié)果顯示TBBPA(10~50μmol/L)以濃度依賴性方式誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞中過量ROS的累積,從而引起線粒體損傷并導(dǎo)致線粒體膜電位下降,最后誘發(fā)HepG2細(xì)胞凋亡。TBBPA代謝混合物對(duì)細(xì)胞ROS含量、線粒體膜電位以及細(xì)胞凋亡的影響較小。TBBPA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞阻滯于G0/G1期,處于S期的細(xì)胞比例減少。TBBPA代謝混合物對(duì)細(xì)胞周期的擾亂作用弱于TBBPA。研究表明,TBBPA對(duì)HepG2的細(xì)胞毒性與細(xì)胞周期調(diào)控及線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān),P.chrysosporium降解TBBPA后產(chǎn)生的代謝混合物表現(xiàn)出更低的細(xì)胞毒性。(3)iTRAQ蛋白質(zhì)組定量分析結(jié)果表明,在P.chrysosporium降解TBBPA的過程中共有148個(gè)蛋白發(fā)生差異表達(dá),其中90個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào),58個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。蛋白功能分析結(jié)果表明,降解過程中P.chrysosporium細(xì)胞內(nèi)2種細(xì)胞色素P450酶、3種谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、2種UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶、1種O-甲基轉(zhuǎn)移酶和其他氧化還原酶的表達(dá)顯著上調(diào),它們可能參與了P.chrysosporium轉(zhuǎn)化TBBPA過程中羥基化、還原脫溴、糖苷化、O-甲基化以及其他氧化反應(yīng)。此外,TBBPA脅迫誘導(dǎo)P.chrysosporium胞內(nèi)磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、丙酮酸脫羧酶、天冬氨酸-tRNA連接酶、絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶4催化亞基的表達(dá)上調(diào),用于產(chǎn)生更多的能量并抵抗氧化脅迫。此外參與氨基酸合成和分解代謝途徑的多種相關(guān)蛋白表達(dá)受到抑制。(4)生物強(qiáng)化降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明水/沉積物樣品中可能存在能降解TBBPA的微生物,未滅菌對(duì)照組中TBBPA的降解率為13.91%,生物強(qiáng)化組、生物強(qiáng)化-生物刺激組中TBBPA的降解率分別顯著提高至40.19%和78.87%。這兩組處理方法均對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響,并導(dǎo)致某些功能菌群得到強(qiáng)化:生物強(qiáng)化使原毛平革菌屬成為水/沉積物體系中的優(yōu)勢真菌,優(yōu)勢細(xì)菌為黃桿菌屬(0.3%~4.4%)和生孢噬纖維菌(1.0%~2.8%)。生物強(qiáng)化-生物刺激處理后,假單胞菌屬大量富集(9.6%~17.3%),生孢噬纖維菌屬(1.0%~5.5%)的比例也有所增加,推測假單胞菌屬可能是TBBPA降解增強(qiáng)的主要原因。此外生孢噬纖維菌屬和黃桿菌屬也具有潛在的TBBPA降解能力。多種與異生素代謝及微生物細(xì)胞自我保護(hù)相關(guān)的功能基因,如烯酰輔酶A水合酶、3-氧�；�-(�；d體蛋白)還原酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、甲基接受趨化蛋白和ATP結(jié)合盒B亞家族在生物強(qiáng)化-生物刺激組中富集。
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：X172;X592
【圖文】：

圖 1-1 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線Fig. 1-1 Scheme of methodology1.6.4 創(chuàng)新點(diǎn)（1）本研究對(duì) P. chrysosporium 降解 TBBPA 的代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)除了脫溴和 β 斷裂，真菌還能夠通過糖苷化和羥基化途徑轉(zhuǎn)化 TBBPA，相應(yīng)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為四溴雙酚 A 葡萄糖苷、三溴雙酚 A 葡萄糖苷和單羥基四溴雙酚 A，為從細(xì)胞水平揭示真菌降解和轉(zhuǎn)化 TBBPA 的機(jī)理提供了更多理論基礎(chǔ)。（2）利用蛋白組學(xué)分析方法，考察 P. chrysosporium 降解 TBBPA 和抵御脅迫的關(guān)鍵功能蛋白，從蛋白質(zhì)水平揭示了 P. chrysosporium 降解 TBBPA 的內(nèi)在分子機(jī)制。

第二章 P. chrysosporium 去除 TBBPA 的性能研究樣品的分析和測定上清液，用 1 mol/L 氫氧化鈉溶液將 pH 調(diào)整為 9，充分搖璃纖維濾膜過濾后，用于高效液相色譜儀定量分析。具體的色譜柱規(guī)格為 Kromasil 100-5C18 (AKZONOBEL 250 mm 體積為 20 μL，流速為 0.8 mL/min，柱溫為 35℃，柱壓約為冰乙酸溶液（含 0.5％乙酸）=85：15（V/V），檢測波長為H 為 9 的超純水配制濃度為 1、2、3、4、5 mg/L 的 TBBPA譜測定峰面積和濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合結(jié)果如圖 2-1 所示。

華南理工大學(xué)碩士學(xué)位論文差異，各組平均值間凡無相同字母的代表具有顯著性差異，異不顯著。論sporium 生長曲線orium 在葡萄糖液體培養(yǎng)基中的生長曲線如圖 2-2 所示。在設(shè)了較完整的生長周期。P.chrysosporium 接種至液體培養(yǎng)基后 2 d 后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期并通過菌絲體纏繞形成菌絲球，第 5進(jìn)入衰亡期。處于對(duì)數(shù)增殖期的菌體活性較強(qiáng)，對(duì)底物有較究選用處于對(duì)數(shù)期的菌體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2806788