【摘要】：本實(shí)驗(yàn)室從生產(chǎn)煙嘧磺隆農(nóng)藥廠的廢水處理池采集污水,分離并鑒定出一株高效降解煙嘧磺隆的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)YB1菌株,同時(shí)對(duì)該菌株降解煙嘧磺隆的條件進(jìn)行了最適降解條件的篩選,之后通過(guò)DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱進(jìn)行分離,Native-PAGE和SDS-PAGE的方法從YB1菌株的胞外酶中分離得到了三種降解酶,分別為錳結(jié)合ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、植物過(guò)氧化氫酶1和乙偶姻脫氫酶E1。本研究在此基礎(chǔ)上,通過(guò)原核表達(dá)的方法,成功獲得了三種胞外酶的可溶性酶液,利用水解圈試驗(yàn)和高效液相色譜儀驗(yàn)證三種降解酶對(duì)煙嘧磺隆的降解活性后,將降解產(chǎn)物進(jìn)行提取,采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定了YB1菌株和三種降解酶對(duì)煙嘧磺隆的降解產(chǎn)物,同時(shí)初步確定了YB1菌株和三種降解酶對(duì)煙嘧磺隆的降解途徑,得到了兩種主要降解產(chǎn)物分別是4,6-二羥基嘧啶和2-氨基-4,6-二甲氧基嘧啶。通過(guò)對(duì)兩種主要降解產(chǎn)物進(jìn)行毒性測(cè)定3種水生生物、蚯蚓以及6種非靶標(biāo)植物,明確了兩種降解產(chǎn)物對(duì)3種水生生物、蚯蚓以及6種非靶標(biāo)植物的毒性等級(jí)均為“低毒”。其具體結(jié)果如下:1.本研究成功在大腸桿菌中表達(dá)了三種基因編碼的煙嘧磺隆降解酶。采用常規(guī)分子生物學(xué)手段對(duì)三種降解酶進(jìn)行原核表達(dá)和蛋白純化,三種降解酶均得到了較高純度的蛋白,其中這三種降解酶分別為錳結(jié)合ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、植物過(guò)氧化氫酶1和乙偶姻脫氫酶E1。采用平板水解圈的方法測(cè)定錳結(jié)合ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、植物過(guò)氧化氫酶1和乙偶姻脫氫酶E1對(duì)煙嘧磺隆的降解效果,結(jié)果表明,這三種降解酶均可以不同程度地降解煙嘧磺隆,其中植物過(guò)氧化氫酶1的降解效果最好,3 h時(shí)對(duì)初始濃度為1000mg/L的煙嘧磺隆降解率達(dá)76.70%;其次是乙偶姻脫氫酶E1,降解率為57.11%;最后是錳結(jié)合ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的降解率為40.25%。2.本研究通過(guò)對(duì)YB1菌株和錳結(jié)合ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、植物過(guò)氧化氫酶1和乙偶姻脫氫酶E1蛋白降解煙嘧磺隆的降解產(chǎn)物測(cè)定,經(jīng)分析,發(fā)現(xiàn)三種降解酶與YB1菌株對(duì)煙嘧磺隆的降解產(chǎn)物完全一致。通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定在正離子模式下質(zhì)荷比為156m/z、230m/z和274m/z的三個(gè)片段分別為2-氨基-4,6-二甲氧基嘧啶、2-氨基磺�；�-N,N-二甲基煙酰胺和((4-(二甲基氨基甲�；�)吡啶-2-基)磺�；�)氨基甲酸,此三種降解產(chǎn)物的產(chǎn)生歸結(jié)于煙嘧磺隆磺酰脲橋中C-N鍵的斷裂。而片段304 m/z的產(chǎn)生則是源于吡啶環(huán)的開環(huán)和磺酰脲橋的斷裂,為1-(4,6-二甲氧基-嘧啶-2-基)-3-(2-甲基亞氨基甲烷磺�；�-乙酰基)-脲,而質(zhì)荷比為111 m/z的片段為4,6-二羥基嘧啶,則是由2-氨基-4,6-二甲氧基嘧啶進(jìn)一步降解形成。3.測(cè)定了煙嘧磺隆和兩種主要降解產(chǎn)物對(duì)斑馬魚、大型n灪托鄙ち性

本文編號(hào)：2749564