【摘要】：木質(zhì)素是一種高分子的聚合物,在自然界中的含量?jī)H僅低于纖維素,作為苯丙烷的基本結(jié)構(gòu)單元,其連接形式通過(guò)C-C鍵和C-O-C鍵相互連接,從而構(gòu)成無(wú)規(guī)則的空間三維結(jié)構(gòu),因而在自然存在的狀態(tài)下難以被降解。目前在利用微生物降解的同時(shí),也使得能產(chǎn)生大量的降解木質(zhì)素的酶對(duì)木質(zhì)素進(jìn)行分解轉(zhuǎn)化,不單單可以治理環(huán)境污染的問(wèn)題,而且可以合理利用自然界中的木質(zhì)素資源。因此,利用合理的方法分離純化木質(zhì)素降解菌,探索產(chǎn)酶能力及發(fā)酵條件,構(gòu)建高效表達(dá)漆酶基因工程菌并應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐顯得尤為重要,這將大大加快木質(zhì)素原料在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的利用步伐,同時(shí)也是制約環(huán)境污染的關(guān)鍵所在。試驗(yàn)一高產(chǎn)漆酶菌株的篩選及鑒定為了獲得高產(chǎn)漆酶的菌株用于降解木質(zhì)素,分別從新鄉(xiāng)周邊腐木堆積處、秸稈堆積處和造紙廠廢水這些木質(zhì)素含量豐富的地方取樣。本研究以木質(zhì)素為唯一碳源,初篩出42株對(duì)木質(zhì)素具有降解能力的菌株,采用愈創(chuàng)木酚平板法對(duì)產(chǎn)漆酶的菌株進(jìn)行復(fù)篩得到4株產(chǎn)漆酶能力較強(qiáng)的真菌菌株,通過(guò)生理生化及18 SrDNA序列分析對(duì)菌株進(jìn)行鑒定,確定了2號(hào)菌株為疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria),6號(hào)菌株為粗毛革孔菌(Coriolopsis gallica),8號(hào)菌株為黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium),11號(hào)菌株為白腐菌(White rot fungi)。并通過(guò)液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)及ABTS法對(duì)漆酶活性木質(zhì)素降解能力進(jìn)行研究。試驗(yàn)二目的菌株產(chǎn)酶能力的比較及發(fā)酵條件的探索研究挑取篩選出來(lái)的四種真菌菌株于液體培養(yǎng)基中,制備粗酶液,并利用ABTS法每天測(cè)定上清液中的酶活力。試驗(yàn)表明,在經(jīng)過(guò)培養(yǎng)6天后,8號(hào)菌株漆酶活力達(dá)到最高,為233.33 U/L。接下來(lái)以黃孢原毛平革菌為目的菌株為研究對(duì)象,利用液態(tài)發(fā)酵研究碳源、氮源、金屬離子、pH、溫度對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響,優(yōu)化產(chǎn)酶條件。結(jié)果表明:該菌株的最優(yōu)碳源為乳糖,最優(yōu)氮源為酵母粉,最適銅離子濃度為0.6 mmol/L,最適溫度為30℃,最適pH為4。在此條件下木質(zhì)素去除率達(dá)到了84.7%,具有良好的降解木質(zhì)素的能力,為進(jìn)一步利用此菌株進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。試驗(yàn)三黃孢原毛平革菌漆酶基因的克隆表達(dá)及蛋白的純化為了獲得高產(chǎn)漆酶的工程菌株,根據(jù)目前已知的黃孢原毛平革菌中的漆酶基因序列,設(shè)計(jì)特異性的引物,通過(guò)PCR擴(kuò)增,可以成功的獲得cds區(qū)為1680bp片段,送生工測(cè)序后對(duì)比發(fā)現(xiàn)此基因的序列與目前已公布的漆酶基因片段的同源性達(dá)98%,這就表明我們成功克隆到了該基因,將其命名為lac1680。在漆酶基因兩段引入Nde I和Xho I進(jìn)行酶切,將切下來(lái)的漆酶基因,通過(guò)pET-24a載體進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌原核菌株中,得到基因工程菌。將我們得到的漆酶的氨基酸序列和GeneBank中現(xiàn)有的真菌漆酶氨基酸序列對(duì)比分析表明:該氨基酸序列與其它真菌漆酶蛋白序列有較高的序列同源性;通過(guò)對(duì)重組菌預(yù)表達(dá)的全菌裂解物進(jìn)行SDS-PAGE,出現(xiàn)75KDa目的條帶,表明誘導(dǎo)表達(dá)成功;預(yù)表達(dá)成功后,通過(guò)收菌,破碎,上樣流出液進(jìn)行NI-NTA的層析柱,對(duì)純化洗脫下來(lái)的mco1-c-His6蛋白進(jìn)行純化;為了更進(jìn)一步的驗(yàn)證這個(gè)條帶就是所需的漆酶條帶,我們通過(guò)WesternBlot方法,洗脫純化后和濃縮后的溶液中在目的位置都出現(xiàn)了75KDa的目的條帶,證明這個(gè)條帶就是誘導(dǎo)純化后的漆酶。并經(jīng)純化回收后,漆酶純度在98%以上。通過(guò)酶學(xué)性質(zhì)的探究,對(duì)比基因工程菌和黃孢原毛平革菌培養(yǎng)不同時(shí)間酶活力的比較,構(gòu)建好的工程菌活力比原菌酶活力有明顯的提高,提高了39%,為進(jìn)一步利用工程菌株進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ),也為以后的應(yīng)用指明了方向。
【學(xué)位授予單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：X172
【圖文】：

圖 2-1 愈創(chuàng)木酚顯色圈大小的比較Fig 2-1 Comparison of guaiacol color ring size表 2-1 不同真菌愈創(chuàng)木酚平板顯色直徑Table 2-1 Different fungi guaiacol plate color diameterer顯色直徑/mm Color diameter/mm1d 3d 5d 7d 0 0 9 21 0 0 7 11 0 10 32 61 0 0 0 12

酶時(shí)間的延長(zhǎng)，在第九天時(shí)顯色直徑達(dá)可達(dá)到69 mm。形態(tài)特征示，2號(hào)菌株菌絲初為白色絨毛狀，培養(yǎng)5天后出現(xiàn)由黃色向過(guò)培養(yǎng)至10天，分生孢子變?yōu)槟G色，菌落成膠狀。6號(hào)菌有的菌絲透明，薄壁，多扭曲，具鎖狀聯(lián)合，有的菌絲無(wú)色菌株菌絲細(xì)長(zhǎng)，分生孢子呈圓形，孢子具有厚壁；11號(hào)菌株，頂端有球形的頂囊，并含有球形的分生孢子。

8S rDNA 電泳檢測(cè)圖（M：DNA MaA electrophoresis detection chart (M:DNA解木質(zhì)素的菌株，我們從特定的自其菌株的形態(tài)學(xué)及 18SrDNA 進(jìn)行鑒為人們帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)水的處理方面也有一定的作用。不斷地進(jìn)步，分子生物學(xué)，基因工大量的木質(zhì)素降解菌，但分泌表達(dá)模的應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中[93]。本研奠定了很好的基礎(chǔ)。已有研究表有活性的微生物加入秸稈中，經(jīng)

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8 胡瑩s

本文編號(hào)：2745034