【摘要】：土霉素是四環(huán)素類抗生素中的一種,因其成本低、易使用,常在畜牧業(yè)中作為飼料添加劑來預防動物疾病并促進動物生長。然而土霉素在畜牧業(yè)中的廣泛應(yīng)用和不徹底降解,造成了普遍的環(huán)境殘留和抗性基因擴散,嚴重威脅了人類生存和安全。自然環(huán)境中微生物降解是去除抗生素殘留的主要手段。本研究在前期篩選獲得一株能夠降解土霉素的菌株OTC-16的基礎(chǔ)上,利用傳統(tǒng)結(jié)合分子生物學手段對該菌株進行了鑒定;從接種量、初始pH、溫度等角度出發(fā)研究了菌株發(fā)揮降解效應(yīng)的環(huán)境適應(yīng)性;對在不同pH條件下菌株在土壤中降解土霉素的實際應(yīng)用效應(yīng)進行了評估;最后利用生物信息學手段挖掘了該菌株的相關(guān)耐藥基因并對菌株的實際抗藥性進行了測定。研究結(jié)果如下:(1)利用傳統(tǒng)結(jié)合分子手段將該菌株鑒定為Arthrobacter nicotianae。除土霉素外,菌株OTC-16還在一定程度上對四環(huán)素和金霉素有降解作用。對菌株的作用機制初步研究發(fā)現(xiàn),菌株OTC-16主要通過生化降解途徑降低土霉素濃度而非簡單的菌體表面吸附,而降解相關(guān)活性物質(zhì)主要通過分泌于胞外發(fā)揮作用。研究了菌株OTC-16發(fā)揮土霉素降解效應(yīng)的環(huán)境適應(yīng)范圍,結(jié)果表明OTC-16菌株在pH 6.0-10.0生長良好,對堿性環(huán)境有較強的適應(yīng)性;對土霉素具有較高的耐受性,在土霉素含量0 mg·L~(-1)-500mg·L~(-1)范圍,OTC-16菌株均能生長良好。其中在接種量、初始pH、溫度和土霉素初始濃度分別為3%(v/v)、pH 9.0、30℃和150 mg·L~(-1)時,菌株OTC-16對土霉素的降解效果最好。(2)土壤模擬試驗評估了菌株OTC-16在不同土壤中的應(yīng)用效果。實驗結(jié)果表明,本研究獲得的降解菌OTC-16在堿性的土壤環(huán)境中去除土霉素殘留具有獨特的優(yōu)勢。培養(yǎng)10 d后,添加的降解菌對在酸性、中性和堿性土壤中的土霉素的降解率分別提高了16.0%,6.3%和40.7%,且添加菌株不會對上述土壤的理化性質(zhì)有不良改變。添加糞肥和秸稈能夠提高土壤中有機質(zhì)含量,但是會抑制土壤中土霉素的降解。因此為解決這個矛盾,在生產(chǎn)實踐中建議去除抗生素殘留和改良土壤分時段進行。對土壤中的16S rRNA和18S rRNA基因豐度分析發(fā)現(xiàn),降解菌OTC-16、糞肥和秸稈的添加均能顯著增加三種土壤中細菌的數(shù)量,且糞肥的作用效果更明顯;秸稈本身對土壤中細菌的增加作用不明顯,但與降解菌混合施用后,在堿性土壤中細菌數(shù)量激增。降解菌OTC-16的添加對三種土壤中真菌的數(shù)量幾乎沒有影響,而糞肥和秸稈卻能顯著提高酸性和中性土壤中真菌的數(shù)量。(3)對土霉素降解菌OTC-16的全基因組測序表明,其基因組總長度為3 797 724bp;含有一個大小為3 643 989 bp的環(huán)狀染色體和兩個質(zhì)粒(一為線形,一為環(huán)狀,大小分別為123 894 bp和29 841 bp)。通過基因注釋,共獲得3 561個基因,其中耐藥基因有23個,大部分分布在質(zhì)粒上。通過耐藥基因(ARDB)數(shù)據(jù)庫注釋,我們得知,OTC-16基因組中存在多種耐藥基因TetV、Tet33、sul1、ant2ia、vanre、vanrc、cml_e6、cml_e8、catb3、cara。其中TetV和Tet33屬于外排泵基因,而Tet33至今報道較少。耐藥譜試驗表明OTC-16菌株能夠耐受土霉素、四環(huán)素、磺胺單甲氧嘧啶、磺胺甲惡唑等15種抗生素。與經(jīng)生物信息學手段預測的耐藥基因基本具有一致性,實驗初步揭示了菌株的耐藥機制。
【學位授予單位】：浙江農(nóng)林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：X172;X53
【圖文】：

2圖 1.1 四環(huán)素族 3 種抗生素的化學結(jié)構(gòu)式Figure 1.1 Chemical structure of three antibiotics of tetracycline土霉素（Oxytetracycline，OTC）是 20 世紀 40 年代發(fā)現(xiàn)的四環(huán)素族成員，別名 四環(huán)素、地霉素、地靈霉素、氧四環(huán)素等，分子式為 C22H24N2O9, 相對分子量.44，是一種廣譜抗菌素。鹽酸土霉素表觀為淡黃色的結(jié)晶性或無定形粉末；在

長期堆放四環(huán)素藥渣的土壤為來源馴化、篩選了四環(huán)素降解菌株。張樹清等通過外源添加有益降解菌劑（芽孢桿菌），有效去除四環(huán)素類抗生素殘留[57]；Maki 等在一個養(yǎng)魚場底泥中分離得到了能夠耐土霉素、強力霉素生長的的抗性菌，并且發(fā)現(xiàn)二者在其抗性菌作用下發(fā)生了明顯降解[89]。Wen 等用一株白腐真菌的木質(zhì)素過氧化物酶粗提液降解土霉素和四環(huán)素取得了良好的效果[90]。張欣陽等從某制藥廠排污口的水樣中分離篩選到 1 株具有高降解四環(huán)素能力的菌株 4002，經(jīng)鑒定為 Advenella sp.，并對其降解性能進行了研究[91]。抗生素能夠在土壤環(huán)境中長期穩(wěn)定存在，環(huán)境中抗生素的降解方式和速度與抗生素種類及性質(zhì)有關(guān)。四環(huán)素類抗生素在不同的環(huán)境介質(zhì)中因環(huán)境條件的不同而發(fā)生一系列非生物或生物降解反應(yīng)，研究其在不同介質(zhì)中的降解方式、降解機理和影響降解的環(huán)境因子對于探索降低抗生素污染和減少殘留的最佳途徑具有重要的意義。1.3.3 四環(huán)素類抗生素降解途徑及降解產(chǎn)物近年來，人們開始逐漸關(guān)注四環(huán)素類抗生素的降解途徑及降解產(chǎn)物。事實上，土霉素的降解可能會伴隨對環(huán)境毒性更大的中間產(chǎn)物的產(chǎn)生，因此對土霉素的降解途徑及中間代謝產(chǎn)物分析更值得關(guān)注。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號：2739787