【摘要】：隨著工業(yè)、農業(yè)和生活等人為性質的活動增加,重金屬在水環(huán)境中富集情況逐漸加劇,人們的健康受到了嚴重的威脅。因此,為了有效控制重金屬離子污染的危害,一系列較為傳統(tǒng)的重金屬離子分析技術,如原子吸收光譜法(AAS)和原子熒光光譜法(AFS)等,在水體檢測中展開了大規(guī)模應用。然而,這些方法所需儀器較為精密,操作過程比較繁瑣,需要專業(yè)科研人員操作,無法進行實際現(xiàn)場檢測,急需一種快速、高特異、低檢測限、低成本的分析技術來彌補這一不足。在此背景下,具有便捷、高效、低耗費等優(yōu)良性能的生物傳感器獲得了研究者的廣泛關注。因此,本課題利用汞離子(Hg~(2+))特異性的T-Hg~(2+)-T結構以及鉛離子(Pb~(2+))對應的“8-17”DNAzyme,結合DNA等溫信號擴增技術,構建了三種高靈敏和高識別效率的生物傳感器,并成功應用于自然水體痕量重金屬離子的檢測中。主要的研究內容如下:內容一:以T-Hg~(2+)-T所特異的錯配結構作為目標物汞離子的識別探針,在純均相的環(huán)境中,構建了基于鏈置換反應以及核酸外切酶Ⅲ的汞離子比色生物傳感器。本工作體系中,預先進行穩(wěn)定雜交的雙鏈由一條富含T堿基的單鏈和一條可與納米金表面DNA短鏈結合的單鏈組成。汞離子存在時,另一條富含T堿基的單鏈通過錯配的T-Hg~(2+)-T結構與雙鏈發(fā)生鏈置換反應,誘導核酸外切酶Ⅲ所輔助的雙重信號擴增過程。隨著汞離子濃度增高,納米金表面DNA短鏈大量減少,顆粒之間距離得到拉近。由于納米金的表面等離子體共振效應,此時的樣品溶液顏色逐漸地由酒紅色變?yōu)樗{色。測得的吸收光譜中,吸收波長發(fā)生紅移,吸光度逐漸降低。通過與已報道的汞離子分析方法比較,設計的比色生物傳感器具有較寬的檢測范圍(1 nM到10μM)、較低的檢測限(0.90 nM)、較快的檢測時間(30分鐘)和較為簡便的操作步驟(一步反應過程),可用于實際水體痕量汞離子的檢測分析中。內容二:反應的界面由純均相轉移到了電極表面,并繼續(xù)利用核酸外切酶Ⅲ良好的酶切活性,構建了標記型的汞離子電化學生物傳感器。用于形成T-Hg~(2+)-T特異識別結構的其中一條DNA鏈被巧妙地設計為發(fā)夾構型(尾端含有大量T堿基)。汞離子加入后,發(fā)夾鏈的尾端通過T-Hg~(2+)-T結構與單鏈雜交,誘導核酸外切酶Ⅲ催化的雙重信號擴增過程。最終,大量亞甲基藍遠離電極表面,電化學信號大幅度降低。通過優(yōu)化實驗參數,電化學生物傳感器對目標物汞離子的檢測限低至0.227 nM(檢測范圍為500 pM到5μM),重現(xiàn)性和穩(wěn)定性得到了提高,在實際水樣中的檢測精度也與原子熒光光譜法有著較好的一致性。因此,基于目標物誘導以及酶輔助的標記型電化學生物傳感平臺具有用于實際水樣檢測分析的潛力。內容三:沿用了第二項工作的電化學生物傳感檢測技術,基于催化發(fā)夾組裝和納米金架橋功能,構建了無核酸酶輔助和非標記型的鉛離子電化學生物傳感器�！�8-17”DNAzyme的底物鏈被設計為穩(wěn)定的發(fā)夾構型(切割位點位于發(fā)夾的環(huán)部),尾端通過10個腺嘌呤(A)在納米金顆粒表面進行共軛連接。鉛離子將底物鏈切割為兩條DNA單鏈(一條單鏈游離,另一條單鏈繼續(xù)連接在納米金表面)。游離鏈與體系中的三個處于亞穩(wěn)定狀態(tài)的發(fā)夾探針交替雜交完成催化發(fā)夾組裝過程,形成的分支的DNA聚合體與納米金表面的DNA單鏈結合生成三維的DNA/納米金網絡體系并固定在電極上。電極表面的這些帶有負電的DNA鏈能夠依靠靜電作用吸附帶正電的三氯六氨合釕,帶來強烈的電化學信號。與其他已經報道的檢測鉛離子的分析手段相比,以“8-17”DNAzyme特異識別誘導的三重信號擴增策略的電化學生物傳感器對目標物鉛離子在100 pM到5μM的濃度范圍內的檢測限可達到0.095 nM。因此,在沒有任何核酸酶參與的條件下,設計的鉛離子特異的非標記型電化學生物傳感器為實際水樣中痕量鉛離子的分析檢測提供了一個較為有力的新平臺。
【學位授予單位】：濟南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TP212.3;X853
【圖文】：

.1（A）T-Hg2+-T 錯配結構[30]；（B）鉛離子特異 DNAzyme[31]；（C）鉛離子特異“8-17”DNAzym（D）鉛離子特異“8-17”DNAzyme 作用機理[34]（2）比色生物傳感器比色生物傳感器（Colorimetric biosensor），DNA 為識別元件，可將生物信號學信號和視覺信號，即能夠利用肉眼觀測樣品顏色的變化和通過儀器測量樣品對目標物濃度進行定量分析，用時短，成本較低，整體操作便捷，用途廣泛[351.2 為本課題組所在實驗室使用的 UV2600 紫外可見分光光度計（島津公司；日本

錯配結構[30]；（B）鉛離子特異 DNAzyme[31]；（C）鉛離子特異（D）鉛離子特異“8-17”DNAzyme 作用機理[34]物傳感器器（Colorimetric biosensor），DNA 為識別元件，信號，即能夠利用肉眼觀測樣品顏色的變化和通過進行定量分析，用時短，成本較低，整體操作便捷所在實驗室使用的 UV2600 紫外可見分光光度計（

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本文編號：2734268