發(fā)布時(shí)間：2020-06-29 19:45

【摘要】：隨著工業(yè)、農(nóng)業(yè)和生活等人為性質(zhì)的活動(dòng)增加,重金屬在水環(huán)境中富集情況逐漸加劇,人們的健康受到了嚴(yán)重的威脅。因此,為了有效控制重金屬離子污染的危害,一系列較為傳統(tǒng)的重金屬離子分析技術(shù),如原子吸收光譜法(AAS)和原子熒光光譜法(AFS)等,在水體檢測(cè)中展開(kāi)了大規(guī)模應(yīng)用。然而,這些方法所需儀器較為精密,操作過(guò)程比較繁瑣,需要專業(yè)科研人員操作,無(wú)法進(jìn)行實(shí)際現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),急需一種快速、高特異、低檢測(cè)限、低成本的分析技術(shù)來(lái)彌補(bǔ)這一不足。在此背景下,具有便捷、高效、低耗費(fèi)等優(yōu)良性能的生物傳感器獲得了研究者的廣泛關(guān)注。因此,本課題利用汞離子(Hg~(2+))特異性的T-Hg~(2+)-T結(jié)構(gòu)以及鉛離子(Pb~(2+))對(duì)應(yīng)的“8-17”DNAzyme,結(jié)合DNA等溫信號(hào)擴(kuò)增技術(shù),構(gòu)建了三種高靈敏和高識(shí)別效率的生物傳感器,并成功應(yīng)用于自然水體痕量重金屬離子的檢測(cè)中。主要的研究?jī)?nèi)容如下:內(nèi)容一:以T-Hg~(2+)-T所特異的錯(cuò)配結(jié)構(gòu)作為目標(biāo)物汞離子的識(shí)別探針,在純均相的環(huán)境中,構(gòu)建了基于鏈置換反應(yīng)以及核酸外切酶Ⅲ的汞離子比色生物傳感器。本工作體系中,預(yù)先進(jìn)行穩(wěn)定雜交的雙鏈由一條富含T堿基的單鏈和一條可與納米金表面DNA短鏈結(jié)合的單鏈組成。汞離子存在時(shí),另一條富含T堿基的單鏈通過(guò)錯(cuò)配的T-Hg~(2+)-T結(jié)構(gòu)與雙鏈發(fā)生鏈置換反應(yīng),誘導(dǎo)核酸外切酶Ⅲ所輔助的雙重信號(hào)擴(kuò)增過(guò)程。隨著汞離子濃度增高,納米金表面DNA短鏈大量減少,顆粒之間距離得到拉近。由于納米金的表面等離子體共振效應(yīng),此時(shí)的樣品溶液顏色逐漸地由酒紅色變?yōu)樗{(lán)色。測(cè)得的吸收光譜中,吸收波長(zhǎng)發(fā)生紅移,吸光度逐漸降低。通過(guò)與已報(bào)道的汞離子分析方法比較,設(shè)計(jì)的比色生物傳感器具有較寬的檢測(cè)范圍(1 nM到10μM)、較低的檢測(cè)限(0.90 nM)、較快的檢測(cè)時(shí)間(30分鐘)和較為簡(jiǎn)便的操作步驟(一步反應(yīng)過(guò)程),可用于實(shí)際水體痕量汞離子的檢測(cè)分析中。內(nèi)容二:反應(yīng)的界面由純均相轉(zhuǎn)移到了電極表面,并繼續(xù)利用核酸外切酶Ⅲ良好的酶切活性,構(gòu)建了標(biāo)記型的汞離子電化學(xué)生物傳感器。用于形成T-Hg~(2+)-T特異識(shí)別結(jié)構(gòu)的其中一條DNA鏈被巧妙地設(shè)計(jì)為發(fā)夾構(gòu)型(尾端含有大量T堿基)。汞離子加入后,發(fā)夾鏈的尾端通過(guò)T-Hg~(2+)-T結(jié)構(gòu)與單鏈雜交,誘導(dǎo)核酸外切酶Ⅲ催化的雙重信號(hào)擴(kuò)增過(guò)程。最終,大量亞甲基藍(lán)遠(yuǎn)離電極表面,電化學(xué)信號(hào)大幅度降低。通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù),電化學(xué)生物傳感器對(duì)目標(biāo)物汞離子的檢測(cè)限低至0.227 nM(檢測(cè)范圍為500 pM到5μM),重現(xiàn)性和穩(wěn)定性得到了提高,在實(shí)際水樣中的檢測(cè)精度也與原子熒光光譜法有著較好的一致性。因此,基于目標(biāo)物誘導(dǎo)以及酶輔助的標(biāo)記型電化學(xué)生物傳感平臺(tái)具有用于實(shí)際水樣檢測(cè)分析的潛力。內(nèi)容三:沿用了第二項(xiàng)工作的電化學(xué)生物傳感檢測(cè)技術(shù),基于催化發(fā)夾組裝和納米金架橋功能,構(gòu)建了無(wú)核酸酶輔助和非標(biāo)記型的鉛離子電化學(xué)生物傳感器�！�8-17”DNAzyme的底物鏈被設(shè)計(jì)為穩(wěn)定的發(fā)夾構(gòu)型(切割位點(diǎn)位于發(fā)夾的環(huán)部),尾端通過(guò)10個(gè)腺嘌呤(A)在納米金顆粒表面進(jìn)行共軛連接。鉛離子將底物鏈切割為兩條DNA單鏈(一條單鏈游離,另一條單鏈繼續(xù)連接在納米金表面)。游離鏈與體系中的三個(gè)處于亞穩(wěn)定狀態(tài)的發(fā)夾探針交替雜交完成催化發(fā)夾組裝過(guò)程,形成的分支的DNA聚合體與納米金表面的DNA單鏈結(jié)合生成三維的DNA/納米金網(wǎng)絡(luò)體系并固定在電極上。電極表面的這些帶有負(fù)電的DNA鏈能夠依靠靜電作用吸附帶正電的三氯六氨合釕,帶來(lái)強(qiáng)烈的電化學(xué)信號(hào)。與其他已經(jīng)報(bào)道的檢測(cè)鉛離子的分析手段相比,以“8-17”DNAzyme特異識(shí)別誘導(dǎo)的三重信號(hào)擴(kuò)增策略的電化學(xué)生物傳感器對(duì)目標(biāo)物鉛離子在100 pM到5μM的濃度范圍內(nèi)的檢測(cè)限可達(dá)到0.095 nM。因此,在沒(méi)有任何核酸酶參與的條件下,設(shè)計(jì)的鉛離子特異的非標(biāo)記型電化學(xué)生物傳感器為實(shí)際水樣中痕量鉛離子的分析檢測(cè)提供了一個(gè)較為有力的新平臺(tái)。
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TP212.3;X853
【圖文】：

.1（A）T-Hg2+-T 錯(cuò)配結(jié)構(gòu)[30]；（B）鉛離子特異 DNAzyme[31]；（C）鉛離子特異“8-17”DNAzym（D）鉛離子特異“8-17”DNAzyme 作用機(jī)理[34]（2）比色生物傳感器比色生物傳感器（Colorimetric biosensor），DNA 為識(shí)別元件，可將生物信號(hào)學(xué)信號(hào)和視覺(jué)信號(hào)，即能夠利用肉眼觀測(cè)樣品顏色的變化和通過(guò)儀器測(cè)量樣品對(duì)目標(biāo)物濃度進(jìn)行定量分析，用時(shí)短，成本較低，整體操作便捷，用途廣泛[351.2 為本課題組所在實(shí)驗(yàn)室使用的 UV2600 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（島津公司；日本

錯(cuò)配結(jié)構(gòu)[30]；（B）鉛離子特異 DNAzyme[31]；（C）鉛離子特異（D）鉛離子特異“8-17”DNAzyme 作用機(jī)理[34]物傳感器器（Colorimetric biosensor），DNA 為識(shí)別元件，信號(hào)，即能夠利用肉眼觀測(cè)樣品顏色的變化和通過(guò)進(jìn)行定量分析，用時(shí)短，成本較低，整體操作便捷所在實(shí)驗(yàn)室使用的 UV2600 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（

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