【摘要】：鎘(cadmium,Cd)作為一種嚴(yán)重危害公共健康安全的重金屬污染物,廣泛存在于環(huán)境中,且不易降解,可使多種組織損傷甚至癌變。其中腎臟作為機(jī)體重要的排泄器官,對鎘的毒性極為敏感,不同劑量、時間均會導(dǎo)致腎臟出現(xiàn)不同程度的損傷。異葒草素(isoorientin,ISO)是一種具有抗氧化、抗病毒等作用的天然植物提取成分。DNA氧化損傷是由各種刺激導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)氧化性反應(yīng)并誘導(dǎo)DNA損傷的過程。周期阻滯是細(xì)胞為應(yīng)對DNA損傷的反應(yīng)程序。本研究在體外模型建立的基礎(chǔ)上,研究了鎘致腎小管上皮細(xì)胞DNA氧化損傷及細(xì)胞周期的變化,同時探究異葒草素的保護(hù)效應(yīng)。1.鎘對大鼠腎小管上皮細(xì)胞DNA氧化損傷的影響選擇大鼠腎小管上皮細(xì)胞系NRK-52E及原代細(xì)胞(Rat renal tubular cell,rPT細(xì)胞)為研究對象,在培養(yǎng)過程中用不同濃度鎘(0、1.25、2.5、5 μmol/L)處理12 h后進(jìn)行以下試驗(yàn):(1)透射電鏡觀察細(xì)胞核的形態(tài);(2)Western-blot、免疫熒光技術(shù)檢測DNA損傷標(biāo)志性蛋白H2AX的磷酸化水平;(3)流式細(xì)胞術(shù)和ELISA試劑盒分別檢測ROS及8-OHdG的表達(dá)量。結(jié)果表明,與對照組相比,(1)鎘組細(xì)胞核出現(xiàn)了明顯損傷變化,表現(xiàn)為細(xì)胞核的變形損傷;(2)鎘組p-H2AX的表達(dá)量顯著性升高(P0.01),并出現(xiàn)明顯的彗星狀拖尾現(xiàn)象;(3)鎘組ROS及8-OHdG含量顯著性升高(P0.01),且具有濃度依賴性。表明鎘可以引起大鼠腎小管上皮細(xì)胞DNA損傷,這種損傷與氧化應(yīng)激有關(guān)。2.鎘對大鼠腎小管上皮細(xì)胞周期分布的影響以NRK-52E及rPT細(xì)胞為研究對象,進(jìn)行以下試驗(yàn):(1)不同濃度鎘(0、1.25、2.5、5μmol/L)處理12h后,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期的分布,Western-blot檢測p53、p21及細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控蛋白表達(dá)的變化;(2)添加20 μmol/L p53抑制劑(Pifithrin-α,PFT-α)與2.5 μmol/L鎘單獨(dú)或聯(lián)合處理后,Western-blot檢測p53、p21及相關(guān)周期蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明:(1)與對照組相比,鎘處理組細(xì)胞在G1期分布數(shù)量極顯著增多(P0.01),一定范圍內(nèi)具有濃度依賴性;與對照組相比,2.5、5 μmol/L鎘組p53、p21蛋白表達(dá)量顯著性升高(P0.01),Cyclin D1、CDK4 及 Cyclin E1、CDK2 的表達(dá)量極顯著性下降(P0.01);(3)與鎘組相比,PFT-α與鎘共處理組p53、p21蛋白表達(dá)量顯著性下降(P0.01),Cyclin D1、CDK4及Cyclin E1、CDK2的表達(dá)量極顯著性升高(P0.01)。表明鎘可通過p53依賴途徑誘導(dǎo)G1期周期阻滯。3.異葒草素在鎘對大鼠腎小管上皮細(xì)胞損傷中的保護(hù)作用以NRK-52E細(xì)胞為研究對象,通過CCK-8和RTCA法檢測不同濃度異葒草素對細(xì)胞活性的影響,最終選用80 μmol/L異葒草素進(jìn)行后續(xù)研究。2.5 μmol/L鎘單獨(dú)或與80 μmol/L異葒草素聯(lián)合處理大鼠腎小管上皮細(xì)胞12 h后,利用透射電子顯微鏡和單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)觀察細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化及細(xì)胞核DNA損傷、采用流式細(xì)胞術(shù)和ELISA法檢測ROS和8-OHdG含量、采用蛋白免疫印跡法和免疫熒光法檢測p-H2AX蛋白表達(dá)水平、利用流式細(xì)胞術(shù)和蛋白免疫印跡法檢測細(xì)胞周期分布情況以及周期相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示:與鎘單獨(dú)處理組相比,異葒草素與鎘共處理組:(1)細(xì)胞核形態(tài)趨于規(guī)則、DNA損傷減輕、彗星拖尾變短;(2)ROS和8-OHdG水平均極顯著降低(P0.01);(3)p-H2AX蛋白表達(dá)量極顯著降低(P0.01);(4)處于G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量極顯著減少(P0.01)、p53和p21蛋白表達(dá)極顯著降低(P0.01),同時Cyclin D1、CDK4、Cyclin E1和CDK2蛋白表達(dá)顯著升高(P0.05)。以上結(jié)果表明,異葒草素可以通過增強(qiáng)抗氧化能力緩解鎘導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞DNA氧化損傷及周期阻滯。結(jié)論,鎘致氧化應(yīng)激引起大鼠腎小管上皮細(xì)胞DNA損傷,并通過p53依賴途徑使得細(xì)胞周期阻滯在G1期。異葒草素可以通過其抗氧化性緩解鎘引起的大鼠腎小管上皮細(xì)胞DNA氧化損傷,并使得細(xì)胞周期G1期阻滯得到緩解。 【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：X503.1;X171.5;S852.3

【圖文】：

灥Ｓ邐媝“邐^k逡逑圖１－１邋ＤＮＡ損傷示意圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＤＮＡ邋ｄａｍａｇｅ逡逑細(xì)胞周期是細(xì)胞復(fù)制其基因組后進(jìn)入生長和分裂程序的過程，是哺乳動物細(xì)胞正常的逡逑分化增殖過程［７６］。細(xì)胞周期的過程如圖１－２所示，在這個調(diào)控過程中，細(xì)胞周期蛋白（Ｃｙｄｉｎｓ）逡逑是細(xì)胞周期進(jìn)程的正調(diào)節(jié)因子，它們可與特異性細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（ＣＤＫｓ）形成逡逑復(fù)合物并激活其功能。在細(xì)胞周期的Ｇ１／Ｓ期期間，主要需要兩種類型的Ｃｙｄｉｎｓ：邋ＣｙｄｉｎＤ逡逑和Ｃｙｄｉｎ邋ＥＸｙｃｌｉｎ邋Ｄ主要激活ＣＤＫ４和ＣＤＫ６，，而Ｃｙｃｌｉｎ邋Ｅ主要激活ＣＤＫ＾Ｇｌ期是ＤＮＡ逡逑合成的前期，為下一步ＤＮＡ合成進(jìn)行準(zhǔn)備，其進(jìn)展最初取決于ＣｙｄｉｎＤ－ＣＤＫ４／６的蛋白逡逑復(fù)合物，然后是ＣｙｃｌｉｎＥ－ＣＤＫ２［７７ｌ。Ｓ期是ＤＮＡ合成期，這一時期細(xì)胞進(jìn)行ＤＮＡ復(fù)制。逡逑Ｇ２期是ＤＮＡ合成后期

Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＤＮＡ邋ｄａｍａｇｅ逡逑細(xì)胞周期是細(xì)胞復(fù)制其基因組后進(jìn)入生長和分裂程序的過程，是哺乳動物細(xì)胞正常的逡逑分化增殖過程［７６］。細(xì)胞周期的過程如圖１－２所示，在這個調(diào)控過程中，細(xì)胞周期蛋白（Ｃｙｄｉｎｓ）逡逑是細(xì)胞周期進(jìn)程的正調(diào)節(jié)因子，它們可與特異性細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（ＣＤＫｓ）形成逡逑復(fù)合物并激活其功能。在細(xì)胞周期的Ｇ１／Ｓ期期間，主要需要兩種類型的Ｃｙｄｉｎｓ：邋ＣｙｄｉｎＤ逡逑和Ｃｙｄｉｎ邋ＥＸｙｃｌｉｎ邋Ｄ主要激活ＣＤＫ４和ＣＤＫ６，而Ｃｙｃｌｉｎ邋Ｅ主要激活ＣＤＫ＾Ｇｌ期是ＤＮＡ逡逑合成的前期，為下一步ＤＮＡ合成進(jìn)行準(zhǔn)備，其進(jìn)展最初取決于ＣｙｄｉｎＤ－ＣＤＫ４／６的蛋白逡逑復(fù)合物，然后是ＣｙｃｌｉｎＥ－ＣＤＫ２［７７ｌ。Ｓ期是ＤＮＡ合成期，這一時期細(xì)胞進(jìn)行ＤＮＡ復(fù)制。逡逑Ｇ２期是ＤＮＡ合成后期，主要為細(xì)胞有絲分裂做準(zhǔn)備，在這一過程中Ｃｙｃｌｉｎ邋Ｂ作為一種有逡逑絲分裂特異性細(xì)胞周期蛋白起重要調(diào)控作用，可以與Ｃｄｃ２即ＣＤＫ１相結(jié)合，參與Ｇ２／Ｍ逡逑期的進(jìn)程［７８

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本文編號：2712469