【摘要】：核酸適配體因具有高度特異性和專一性以及穩(wěn)定性好、易于化學修飾、目標配體范圍廣等優(yōu)點,廣泛應用于環(huán)境檢測及食品安全分析。本文通過“sol-gel”法制備巰基有機-無機硅膠雜化整體柱,以納米金為連接媒介,制備了具有超高適配體覆蓋密度的有機-無機硅膠雜化親和色譜柱,實現(xiàn)了對赭曲霉毒素A的高靈敏度識別與檢測。主要內容如下:第一章,文獻綜述。概述了毛細管整體柱的類型和研究進展,介紹納米金整體柱的研究進展與應用,重點對核酸適配體的特點以及核酸適配體親和整體柱的研究進展與應用進行的概述,并且對本論文的研究內容及意義進行介紹。第二章,以四甲氧基硅烷(TMOS)和巰丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)作為硅烷化試劑,制備了poly(TMOS-co-MPTMS)雜化硅膠毛細管整體柱;制備了不同尺寸大小的納米金,通過柱后衍生納米金和巰基核酸適配體,制備了Apt@AuNPs@poly(TMOS-co-MPTMS)雜化親和整體柱。實驗考察了所制備的雜化整體柱的組成、形貌結構、能譜分析以及紅外光譜和機械穩(wěn)定性表征。表征了核酸適配體在雜化整體柱上的修飾量,系統(tǒng)考察了基質柱滲透性及納米金粒徑尺寸對Apt@AuNPs@ poly(TMOS-co-MPTMS)雜化親和柱納米金修飾量及對目標物OTA富集、洗脫效果的影響。所制備的Apt@AuNPs@poly(TMOS-co-MPTMS)新型雜化親和整體柱具有高適配體覆蓋密度,可達3,494pmol/uL、穩(wěn)定性強。第三章,基于AuNPs@poly(TMOS-co-MPTMS)柱,開展了核酸適配體雜化親和整體柱對目標物OTA親和性能研究。應用核酸適配體對OTA的特異選擇性及高親和作用力,考察了Apt@AuNPs@poly(TMOS-co-MPTMS)柱對OTA的識別作用;考察了所制備的親和柱對目標物OTA的回收率,并優(yōu)化了洗脫參數(shù);考察了目標物OTA在親和柱上的負載量以及親和整體柱對目標物OTA的檢測限,應用于啤酒等酒類樣品中OTA的分析、檢測以及雜化親和整體柱的使用壽命測試。結果表明,所制備的Apt@Au@poly(TMOS-co-MPTMS)雜化親和整體柱對OTA具有高特異識別能力,穩(wěn)定性較好,使用壽命大于3個月,對標準溶液中的OTA回收率可達92.3±2.1%和92.5±0.5%(n=3),OTA負載量為9.75ng,未經(jīng)大體積進樣富集時檢測限達到0.025 ng/mL。在加標酒樣中雜化親和整體柱對目標物OTA具有較高特異識別能力,在0.5-5 ng/mL的OTA加標濃度范圍,啤酒樣品中OTA的平均回收率在89.6±3.7%-91.8±1.6%之間;葡萄酒樣品中OTA平均回收率在90.3±2.8-91.6±2.7%之間,回收率高。
【圖文】：

適配體需要通過一定的固載方式鍵合到某種載體上，常見的的載體有瓊脂逡逑、微球、芯片、納米粒子及毛細管整體柱材料等。整體柱柱具有通孔和微孔網(wǎng)絡結構；逡逑質速率快；吸附容量高；良好滲透性，流通阻力小；制備簡單，無需柱塞。結合核酸適逡逑體與毛細管整體柱的優(yōu)勢制備出的高效新型的親和色譜固定相材料，在富集、純化小分逡逑化合物、蛋白質等發(fā)揮重要作用，因而核酸適配體鍵合整體柱在色譜分析領域倍受研究逡逑的關注。目前，適配體在毛細管整體柱材料上鍵合技術主要包括：非化學鍵合技術［？７１］逡逑化學鍵合技術兩種。逡逑．２．１非化學鍵合技術逡逑非化學鍵合技術是基于親和作用力來實現(xiàn)適配體與色譜固定相載體的結合。目前，使逡逑該技術來制備核酸適配體整體柱較為成熟的是生物素－鏈霉親和素法。逡逑鏈霉親和素是一種四聚體蛋白，一分子的鏈霉親和素可以與四分子的生物素高度特異逡逑的結合。Ｌｉｕ等［７２］研制了一類親水性、光穩(wěn)定性、生物相容性和高熒光鏈霉親和素功能逡逑二氧化硅納米粒子，制備過程如圖１－４所示，鏈霉親和素功能化二氧化硅納米粒子的研逡逑利用經(jīng)典連鎖技術對反相蛋白質微陣列進行檢測。該納米粒子探針具有熒光性能較好、逡逑測靈敏度高線性范圍寬、檢測限低等優(yōu)點。逡逑？邐＇邐廠邐ｒ￣￣￣ｚ．—）逡逑

逑的覆蓋密度，可達５６８邋ｐｍｏｌ／＾Ｌ。Ｐｉｃｈｏｎ等ｔ７５］同樣借用戊二醛為連接媒介，成功制備了邋ＯＴＡ逡逑適配體功能化的雜化整體柱，如圖１－６－Ｂ所示，實現(xiàn)了對目標物赭曲霉毒素Ａ特異性富集，逡逑平均回收率為８０％，，負載量可達５ｎｇ，并應用于啤酒實際樣品中ＯＴＡ的分析檢測。如圖逡逑１－６＿Ｃ所示，Ｗａｎｇ等［％通過乙二胺在整體柱表面修飾上氨基，然后以戊二醛為連接媒介，逡逑制備抗溶菌酶ＤＮＡ適配體鍵合的有機聚合親和整體柱，實現(xiàn)從雞蛋清中選擇性提取溶菌逡逑酶，具有較好的重現(xiàn)性，同時適配體的覆蓋密度為２９０邋ｐｍｏｌ／＾Ｌ。但這些制備方法涉及多個逡逑步驟，需要整體柱進行反復修飾鍵合，以確保親和材料上適配體的覆蓋密度，這是相對耗逡逑時的。逡逑—ＯＨ逡逑Ａ邐一0Ｈ邋ＮＭ２邋ｌ￡％ｇａｔｔｉｒｒｆｄｒｔｊｄｅ邋’邋ｎ＾＾ＣＨＯ邐＿逡逑”ＮＭ２邐＾ＣＨＯ邋ＰＢ４＾00ｍＭ邋Ｎ？ＣＨ２０？ｄＭ邋ＫＣｉ逡逑一０？邐－ＯＨ逡逑Ｈｙｂｒｉｄ邋ｓｉｌｉｃａ邋ｍ
【學位授予單位】：福州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：X836;O652.6

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本文編號：2699643