【摘要】：隨著我國(guó)城鎮(zhèn)化步伐的加快、工農(nóng)業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的大規(guī)模發(fā)展,含有高濃度氮的廢水排放量不斷增加,造成大量氮素滲入地表和地下徑流,而產(chǎn)生水體富營(yíng)養(yǎng)化等問(wèn)題,嚴(yán)重威脅著生態(tài)環(huán)境的平衡。在廢水脫氮工藝中,生物脫氮較傳統(tǒng)的物化法脫氮技術(shù)具有經(jīng)濟(jì)高效,操作簡(jiǎn)單,且不容易對(duì)環(huán)境造成二次污染的優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)室前期分離純化得到一株具備高效脫氮功能的細(xì)菌嗜堿鹽單胞菌(Halomonas alkaliphila)X3,研究X3菌株的氮代謝相關(guān)機(jī)理,對(duì)日后該菌株在廢水脫氮中的高效應(yīng)用和探究該類菌在海洋氮循環(huán)中的地位都具有重要意義,本文通過(guò)酶活檢測(cè)、PCR、qRT-PCR檢測(cè)等方法,對(duì)Halomonas alkaliphila X3氮代謝途徑及相關(guān)酶的存在和功能進(jìn)行了驗(yàn)證,并利用多種軟件對(duì)各基因編碼的相應(yīng)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、3D結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育等進(jìn)行了分析,主要結(jié)果如下:(1)通過(guò)PCR反應(yīng),驗(yàn)證全基因組測(cè)序預(yù)測(cè)到的nasA和narGYVJ的存在,未擴(kuò)增到?jīng)]有預(yù)測(cè)到AMO、HAO、Nap、Nir、Nos和Nor相關(guān)功能基因的片段,同時(shí)培養(yǎng)過(guò)程中,未檢測(cè)到硝化反應(yīng)的關(guān)鍵中間產(chǎn)物羥胺和反硝化反應(yīng)產(chǎn)生的氣體,因此初步判斷Halomonas alkaliphila X3的氮代謝途徑中不存在編碼AMO、HAO、Nap、Nir、Nos和Nor等各種酶的功能基因,可能不存在硝化和反硝化路徑,其對(duì)無(wú)機(jī)氮的利用是通過(guò)硝酸鹽的異化和同化反應(yīng)途徑實(shí)現(xiàn)的,即分別在異化型硝酸鹽還原酶Nar和同化型硝酸鹽還原酶NasA的催化作用下,將硝酸鹽轉(zhuǎn)化生成亞硝酸鹽,再轉(zhuǎn)化成氨氮,再合成細(xì)胞物質(zhì)的。(2)Halomonas alkaliphila X3氮代謝通路中存在異化型硝酸鹽還原酶Nar,且具有表達(dá)活性。該酶催化硝酸鹽轉(zhuǎn)化到亞硝酸鹽的反應(yīng),且酶活性為每克蛋白21.415 U。Halomonas alkaliphila X3中的Nar由α、β、γ和δ四個(gè)亞基構(gòu)成,分別由為narG、narY、narV和narJ編碼。基因簇narGYJV編碼的蛋白功能區(qū)域中1-1246氨基酸屬于NarG超家族,構(gòu)成Nar的α亞基;1261-1752氨基酸屬于DMSOR-beta-like超家族,構(gòu)成Nar的β亞基,2061-2279氨基酸構(gòu)成γ亞基,1802-2018氨基酸構(gòu)成δ亞基。NarG、NarY和NarV的3D結(jié)構(gòu)與PDB中大腸桿菌的1Q16模型的3D結(jié)構(gòu)最接近,覆蓋率達(dá)96-100%。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示X3菌株中NarG在同菌屬中遺傳距離較近,與坎帕尼亞鹽單胞菌(Halomonas campaniensis)和鹽單胞菌屬(Halomonas sp.)WN018的一致性最高,高達(dá)99%;NarG在不同菌屬間雖然功能相似,但同源性較低。NarY與大腸埃希菌(Escherichia coli)中的氨基酸序列的同源關(guān)系較近,證明異化型硝酸鹽還原酶Nar中不同亞基的演化方向和系統(tǒng)發(fā)育地位均不同。(3)Halomonas alkaliphila X3中存在同化型硝酸鹽還原酶NasA;經(jīng)拼接獲得了其功能基因nasA全長(zhǎng)為2739 bp的全序列;發(fā)現(xiàn)該基因具有表達(dá)活性,且其在好氧條件下的表達(dá)量高于厭氧條件下的;預(yù)測(cè)到Halomonas alkaliphila X3的NasA中存在固氮酶中都含有的Mo元素,且NasA中未預(yù)測(cè)到信號(hào)肽,證明其是胞內(nèi)酶;NasA的氨基酸中13-587氨基酸屬于Molybdopterin-binding超家族;594-712氨基酸屬于MopB_CT超家族;847-896氨基酸屬于NirB超家族。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹分析,X3菌株的nasA基因與Halomonas campaniensis和Halomonas sp.TD01的同源性最高,nasA基因在不同的菌屬之間的差異性較大,NasA的蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)與PDB庫(kù)中硫酸鹽脫硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)的硝酸鹽還原酶(NapA)同源性較高。
【圖文】：

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文電泳檢驗(yàn)結(jié)果，電泳條帶清晰，并未彌散，證明已成功獲DNA 樣品，，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。株中預(yù)測(cè)到的 narGYJV 基因簇各亞基基因和 nasA 基因的擴(kuò)增，均獲得單一目標(biāo)長(zhǎng)度的條帶(圖 2-1 b、c)，且經(jīng)生物序列高度相符，從而驗(yàn)證了這兩類基因的存在真實(shí)性。

X3 中 amo、hao、nap、nirK、nirS、nos 和 nor 各基因 Pvalidation of amo, hao, nap, nirK, nirS, nos and nor genes inarker, 1: 引物為 AMO1F/AMO2R, 2: 引物為 AMOB/AM物為 HAOⅠ1/HAOⅠ2, 5: 引物為 NAP1/NAP2, 6: 引物S/nirS6R, 8: 引物為 nosZ-F/nosZ1622R, 9: 引物為 norBF/對(duì)照A marker, 1: Primers areAMO1F/AMO2R, 2: Primers are A/HAO2, 4: Primers are HAOⅠ1/HAOⅠ2, 5: Primers are N/nirK 5R, 7: Primers are F3nirS/nirS6R, 8: Primers are nosZ9: Primers are norBF/norBR, 10: negative control證結(jié)果 X3 菌株培養(yǎng)基內(nèi)羥胺濃度變化，如表 2-1 所示，度均接近零，無(wú)明顯差異，且各時(shí)間間隔測(cè)得羥
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：X703;X172

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2673133