【摘要】：隨著我國城鎮(zhèn)化步伐的加快、工農業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的大規(guī)模發(fā)展,含有高濃度氮的廢水排放量不斷增加,造成大量氮素滲入地表和地下徑流,而產生水體富營養(yǎng)化等問題,嚴重威脅著生態(tài)環(huán)境的平衡。在廢水脫氮工藝中,生物脫氮較傳統的物化法脫氮技術具有經濟高效,操作簡單,且不容易對環(huán)境造成二次污染的優(yōu)勢。本實驗室前期分離純化得到一株具備高效脫氮功能的細菌嗜堿鹽單胞菌(Halomonas alkaliphila)X3,研究X3菌株的氮代謝相關機理,對日后該菌株在廢水脫氮中的高效應用和探究該類菌在海洋氮循環(huán)中的地位都具有重要意義,本文通過酶活檢測、PCR、qRT-PCR檢測等方法,對Halomonas alkaliphila X3氮代謝途徑及相關酶的存在和功能進行了驗證,并利用多種軟件對各基因編碼的相應蛋白質的二級結構、3D結構和系統發(fā)育等進行了分析,主要結果如下:(1)通過PCR反應,驗證全基因組測序預測到的nasA和narGYVJ的存在,未擴增到沒有預測到AMO、HAO、Nap、Nir、Nos和Nor相關功能基因的片段,同時培養(yǎng)過程中,未檢測到硝化反應的關鍵中間產物羥胺和反硝化反應產生的氣體,因此初步判斷Halomonas alkaliphila X3的氮代謝途徑中不存在編碼AMO、HAO、Nap、Nir、Nos和Nor等各種酶的功能基因,可能不存在硝化和反硝化路徑,其對無機氮的利用是通過硝酸鹽的異化和同化反應途徑實現的,即分別在異化型硝酸鹽還原酶Nar和同化型硝酸鹽還原酶NasA的催化作用下,將硝酸鹽轉化生成亞硝酸鹽,再轉化成氨氮,再合成細胞物質的。(2)Halomonas alkaliphila X3氮代謝通路中存在異化型硝酸鹽還原酶Nar,且具有表達活性。該酶催化硝酸鹽轉化到亞硝酸鹽的反應,且酶活性為每克蛋白21.415 U。Halomonas alkaliphila X3中的Nar由α、β、γ和δ四個亞基構成,分別由為narG、narY、narV和narJ編碼�；虼豱arGYJV編碼的蛋白功能區(qū)域中1-1246氨基酸屬于NarG超家族,構成Nar的α亞基;1261-1752氨基酸屬于DMSOR-beta-like超家族,構成Nar的β亞基,2061-2279氨基酸構成γ亞基,1802-2018氨基酸構成δ亞基。NarG、NarY和NarV的3D結構與PDB中大腸桿菌的1Q16模型的3D結構最接近,覆蓋率達96-100%。系統發(fā)育樹顯示X3菌株中NarG在同菌屬中遺傳距離較近,與坎帕尼亞鹽單胞菌(Halomonas campaniensis)和鹽單胞菌屬(Halomonas sp.)WN018的一致性最高,高達99%;NarG在不同菌屬間雖然功能相似,但同源性較低。NarY與大腸埃希菌(Escherichia coli)中的氨基酸序列的同源關系較近,證明異化型硝酸鹽還原酶Nar中不同亞基的演化方向和系統發(fā)育地位均不同。(3)Halomonas alkaliphila X3中存在同化型硝酸鹽還原酶NasA;經拼接獲得了其功能基因nasA全長為2739 bp的全序列;發(fā)現該基因具有表達活性,且其在好氧條件下的表達量高于厭氧條件下的;預測到Halomonas alkaliphila X3的NasA中存在固氮酶中都含有的Mo元素,且NasA中未預測到信號肽,證明其是胞內酶;NasA的氨基酸中13-587氨基酸屬于Molybdopterin-binding超家族;594-712氨基酸屬于MopB_CT超家族;847-896氨基酸屬于NirB超家族。通過系統發(fā)育樹分析,X3菌株的nasA基因與Halomonas campaniensis和Halomonas sp.TD01的同源性最高,nasA基因在不同的菌屬之間的差異性較大,NasA的蛋白質3D結構與PDB庫中硫酸鹽脫硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)的硝酸鹽還原酶(NapA)同源性較高。
【圖文】：

上海海洋大學碩士學位論文電泳檢驗結果，電泳條帶清晰，并未彌散，證明已成功獲DNA 樣品，，可以進行后續(xù)實驗。株中預測到的 narGYJV 基因簇各亞基基因和 nasA 基因的擴增，均獲得單一目標長度的條帶(圖 2-1 b、c)，且經生物序列高度相符，從而驗證了這兩類基因的存在真實性。

X3 中 amo、hao、nap、nirK、nirS、nos 和 nor 各基因 Pvalidation of amo, hao, nap, nirK, nirS, nos and nor genes inarker, 1: 引物為 AMO1F/AMO2R, 2: 引物為 AMOB/AM物為 HAOⅠ1/HAOⅠ2, 5: 引物為 NAP1/NAP2, 6: 引物S/nirS6R, 8: 引物為 nosZ-F/nosZ1622R, 9: 引物為 norBF/對照A marker, 1: Primers areAMO1F/AMO2R, 2: Primers are A/HAO2, 4: Primers are HAOⅠ1/HAOⅠ2, 5: Primers are N/nirK 5R, 7: Primers are F3nirS/nirS6R, 8: Primers are nosZ9: Primers are norBF/norBR, 10: negative control證結果 X3 菌株培養(yǎng)基內羥胺濃度變化，如表 2-1 所示，度均接近零，無明顯差異，且各時間間隔測得羥
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：X703;X172

【參考文獻】

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本文編號：2673133