【摘要】：目前,大量國(guó)內(nèi)外研究表明人類正頻繁受到內(nèi)分泌干擾物(Endocrine disrupting chemicals,EDCs)的暴露威脅。因此,雙酚A(Bisphenol A,BPA)等毒性效應(yīng)明確、嚴(yán)重威脅人類健康的EDCs在世界范圍內(nèi)受到了管控或禁用。隨著B(niǎo)PA的禁用,諸如雙酚AF(Bisphenol AF,BPAF)、雙酚F(Bisphenol F,BPF)和雙酚S(Bisphenol S,BPS)等雙酚類似物大量涌入市場(chǎng)。然而,越來(lái)越多的研究表明,這些與BPA結(jié)構(gòu)相似的替代物也同樣具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。因此,為了更加高效地進(jìn)行EDCs的篩選,以尋找更安全可靠的替代物,必須開(kāi)發(fā)和建立更全面、更深入的毒性評(píng)價(jià)方法。本論文以BPA及其典型替代物BPAF、BPF和BPS為研究對(duì)象,一方面,以H295R細(xì)胞為體外模型,采用UPLC-MS/MS技術(shù)評(píng)價(jià)了雙酚A及其典型替代物對(duì)激素合成與分泌水平的干擾效應(yīng),建立了同時(shí)測(cè)定多種激素的檢測(cè)方法,為尋找更安全的雙酚A替代物提供了技術(shù)支持;另一方面,以代謝敏感的HepG2細(xì)胞為體外模型,結(jié)合~1H-NMR和PCR Array兩種高通量技術(shù)探究了雙酚A及其替代物的代謝擾動(dòng)效應(yīng)和可能的代謝調(diào)控機(jī)制,彌補(bǔ)了BPA及其替代物在代謝組學(xué)研究上的空白,利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與非靶標(biāo)的代謝組學(xué)技術(shù)進(jìn)行毒性靶點(diǎn)的初篩也為化合物及其替代物的毒性評(píng)價(jià)提供了一種全新的研究思路和方法。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果包括以下兩個(gè)部分:(1)采用UPLC-MS/MS技術(shù)建立了同時(shí)測(cè)定9種類固醇激素的方法,并以H295R細(xì)胞為模型,研究BPA、BPAF、BPF和BPS暴露對(duì)胞外激素分泌水平的影響,以評(píng)價(jià)BPA及其替代物的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。結(jié)果表明:所建立的UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定9種類固醇激素方法的專屬性、精確度和準(zhǔn)確度良好,各目標(biāo)激素在線性范圍內(nèi)均線性良好(r~20.99),且檢測(cè)限和定量限均?1 ng/mL(孕酮、雄烯二酮和睪酮的定量限?0.05 ng/mL),基質(zhì)效應(yīng)在83.87~119.46%之間,回收率均在80.03~113.32%范圍內(nèi)。此外,對(duì)H295R細(xì)胞胞外類固醇激素水平的測(cè)定結(jié)果顯示,BPA與BPF對(duì)孕酮、17α-羥基孕酮、雄烯二酮、睪酮和17β-雌二醇的干擾能力均相近,且對(duì)孕酮、17α-羥基孕酮和17β-雌二醇的干擾能力強(qiáng)于BPAF和BPS。此外,4種BPs在10~-66 M濃度下均能顯著下調(diào)雄烯二酮和睪酮水平并顯著上調(diào)17β-雌二醇水平,即均有雌激素激動(dòng)作用和雄激素抑制作用。通過(guò)比較各激素水平發(fā)生顯著變化的濃度,發(fā)現(xiàn)BPA及其三種典型替代物的激素干擾能力由強(qiáng)到弱為:BPA、BPFBPSBPAF。(2)采用~1H-NMR和PCR Array技術(shù)研究BPA、BPAF、BPF和BPS暴露對(duì)HepG2細(xì)胞胞外代謝產(chǎn)物和胞內(nèi)相關(guān)代謝基因表達(dá)水平的影響,從基因和代謝層面系統(tǒng)探究BPA及其替代物對(duì)人體健康的可能風(fēng)險(xiǎn)和毒作用分子機(jī)制。結(jié)果表明:BPA及其替代物能對(duì)7~15種代謝產(chǎn)物產(chǎn)生干擾,包括丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸等氨基酸,乙酸、乳酸、丙酮酸等糖酵解和三羧酸循環(huán)的中間體或終產(chǎn)物。此外,這些差異性代謝產(chǎn)物與3~8條代謝通路的擾動(dòng)相關(guān),其中包括丙酮酸代謝和丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代謝等常見(jiàn)的代謝通路。通過(guò)比較差異性代謝產(chǎn)物和受擾動(dòng)代謝通路的數(shù)量,發(fā)現(xiàn)BPA及其三種典型替代物的代謝擾動(dòng)能力由強(qiáng)到弱為:BPFBPABPAFBPS。通過(guò)糖代謝PCR Array分析發(fā)現(xiàn),BPAF能通過(guò)上調(diào)丙酮酸激酶相關(guān)基因(PKLR)的表達(dá)水平以干擾糖代謝過(guò)程,而B(niǎo)PA、BPF和BPS能通過(guò)下調(diào)葡萄糖激酶相關(guān)基因(GCK)的表達(dá)水平以抑制葡萄糖感應(yīng)功能發(fā)揮作用。綜上,結(jié)合代謝組學(xué)和PCR Array技術(shù)探究潛在的代謝調(diào)控機(jī)制,并為未來(lái)的靶向風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估確定潛在目標(biāo)是有潛力的。
【圖文】：

浙江工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文結(jié)果 A 及其替代物對(duì) H295R 細(xì)胞活性的影響采用 MTS 法研究了 BPA、BPAF、BPF 和 BPS 對(duì) H295R 細(xì)胞活固醇激素分泌水平測(cè)定實(shí)驗(yàn)中的藥物濃度選擇（圖 3-1）。與溶10-5M 濃度下，，BPA 及其 3 種典型替代物 BPAF、BPF 和 BPS 均出顯著的細(xì)胞毒性（p＜0.05）；在10-9M~10-6M濃度下，各處理組顯著的細(xì)胞毒性（p＞0.05）。為排除細(xì)胞死亡對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，細(xì)胞毒性濃度（10-9、10-8、10-7和 10-6M）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

27圖 3-2 質(zhì)控樣品中各目標(biāo)化合物的 MRM 色譜圖Figure 3-2. MRM chromatogram of target compounds in QC samples.
【學(xué)位授予單位】：浙江工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：X703

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7 鄔e

本文編號(hào)：2660749