【摘要】：四環(huán)素類抗生素是全世界近幾十年來畜禽生產(chǎn)過程使用最廣泛、頻度最高、用量最大的一類;但影響此類抗生素抗性基因經(jīng)接合轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的自然因素少有報(bào)道,本研究以強(qiáng)力霉素抗性基因(Dox)為研究對(duì)象,(1)通過7個(gè)細(xì)菌性病原菌(其中6個(gè)為臨床分離的病原菌,遺傳背景不清楚;1個(gè)為條件性致病性產(chǎn)酸克雷伯氏菌的突變株TR-M30-1,為mTn5gusA-pgfp21轉(zhuǎn)座子插入突變,Kan~R(卡那霉素抗性),本實(shí)驗(yàn)室保存)對(duì)18種常用抗生素的藥敏實(shí)驗(yàn)獲得此7個(gè)菌株的耐藥譜,從耐藥譜中篩選出抗生素抗性遺傳型為Dox~RX~S的候選供體菌和抗生素抗性遺傳型為Dox~SX~R的候選受體菌(X代表試驗(yàn)的18種抗生素中的任何一種);(2)供、受體菌共接合培養(yǎng)后篩選出抗生素抗性遺傳型為Dox~RX~R的接合子,同時(shí)確定目標(biāo)供、受體菌;(3)對(duì)目標(biāo)供、受體菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化、分子生物學(xué)和BIOLOG方法鑒定;(4)確定目標(biāo)供、受體菌的四環(huán)素耐藥基因及其可移動(dòng)遺傳元件;(5)檢測(cè)養(yǎng)豬場(chǎng)排污渠不同地段和不同濃度的有機(jī)肥浸出液對(duì)目標(biāo)供、受體菌的存活率及目標(biāo)供體菌的Dox基因經(jīng)接合轉(zhuǎn)移至目標(biāo)受體菌的效率;(6)構(gòu)建狐尾藻(Myriophyllum spicatum L)、水葫蘆(Eichharnia crassipes)、狐尾藻+水葫蘆和無植物(空白對(duì)照)的下流式人工濕地,檢測(cè)目標(biāo)供、受體菌在人工濕地水體內(nèi)的存活率及目標(biāo)供體菌的Dox基因經(jīng)接合轉(zhuǎn)移至目標(biāo)受體菌的效率;(7)分析了強(qiáng)力霉素抗性基因(Dox)在供、受體菌之間的接合轉(zhuǎn)移效率與養(yǎng)豬場(chǎng)排污渠水體和人工濕地水體的pH值、化學(xué)需氧量(COD)、氨基酸種類和含量、總糖、還原糖、凱氏氮、總磷(TP)、有效磷的含量的相關(guān)性;(8)檢測(cè)了人工濕地對(duì)COD去除效果;結(jié)果如下:(1)研究的7個(gè)病原菌耐藥性均為多重性,最多能耐受15種抗生素,對(duì)鏈霉素(氨基糖苷類)、萘啶酮酸(喹諾酮類)、磺胺二甲嘧啶(磺胺類)抗生素的耐藥率最高(100%),對(duì)慶大霉素(氨基糖苷類)、諾氟沙星(喹諾酮類)、環(huán)丙沙星(喹諾酮類)抗生素的耐藥率最低(0)。目標(biāo)供體菌抗生素抗性基因型選定為Dox~RKan~S,目標(biāo)受體菌為Dox~SKan~R,接合子為Dox~RKan~R;接合子命名為Con-Ⅱ。(2)抗生素抗性基因型Dox~RKan~S的目標(biāo)供體菌鑒定為Escherichia coli O157:H7(E.coli O157:H7);BIOLOG法鑒定目標(biāo)受體菌TR-M30-1(Dox~SKan~R)的結(jié)果與于曉宇的16S rDNA分子鑒定的結(jié)果一致,均為產(chǎn)酸克雷伯氏菌。(3)E.coli O157:H7(Dox~RKan~S)、TR-M30-1(Dox~SKan~R)、Con-Ⅱ(Dox~RKan~R)的四環(huán)素抗性基因和可移動(dòng)遺傳元件檢測(cè)結(jié)果為E.coli O157:H7(Dox~RKan~S)和Con-Ⅱ(Dox~RKan~R)攜帶tetB耐藥基因,TR-M30-1(Dox~SKan~R)無。E.coli O157:H7(Dox~RKan~S)含F(xiàn)質(zhì)粒、I類整合子和I類整合子可變區(qū);TR-M30-1(Dox~SKan~R)含F(xiàn)質(zhì)粒和I類整合子可變區(qū);Con-Ⅱ(Dox~RKan~R)含F(xiàn)質(zhì)粒和I類整合子。Con-Ⅱ(Dox~RKan~R)的Dox~R并非由F質(zhì)粒從E.coli O157:H7(Dox~RKan~S)介導(dǎo)轉(zhuǎn)移至TR-M30-1(Dox~SKan~R)的結(jié)果。(4)歷時(shí)9 d,于第3、6、9 d測(cè)定,E.coli O157:H7(Dox~RKan~S)和TR-M30-1(Dox~SKan~R)在完全培養(yǎng)基(LB)、養(yǎng)豬場(chǎng)排污渠不同地段水體、不同濃度的有機(jī)肥浸出液及人工濕地系統(tǒng)水體中其存活率較原始濃度(0 d)均逐漸下降且處理組的下降速率較對(duì)照(LB培養(yǎng)基)者大;在LB培養(yǎng)基內(nèi),兩者第3 d存活率無差異(從平均值±標(biāo)準(zhǔn)差判斷,下同),但第6、9 d時(shí),TR-M30-1(Dox~SKan~R)存活率大于E.coli O157:H7(Dox~RKan~S);有機(jī)質(zhì)污染水體(養(yǎng)豬場(chǎng)污水和有機(jī)肥浸出液)中兩者的存活率高于人工濕地水體。在時(shí)間維度上(0-3 d,3-6 d,6-9 d),存活率呈現(xiàn)特征:(1)減-減-增者為:養(yǎng)豬場(chǎng)排污渠3個(gè)地段(上、中、下游)污水、150 g有機(jī)肥+1 L蒸餾水中的E.coli O157:H7(Dox~RKan~S);養(yǎng)豬場(chǎng)排污渠(上、下)游、(150、100、50)g有機(jī)肥+1 L蒸餾水、狐尾藻人工濕地環(huán)境中的TR-M30-1(Dox~SKan~R);(2)減-增-減者為:最大持水量狀態(tài)有機(jī)肥(含水量57%)、(100、50)g有機(jī)肥+1 L蒸餾水、無植物人工濕地水體中的E.coli O157:H7(Dox~RKan~S);200 g有機(jī)肥+1 L蒸餾水中的TR-M30-1(Dox~SKan~R);(3)減-減-減者為:(1)和(2)以外的其他試驗(yàn)條件,如:(200、10)g有機(jī)肥+1 L蒸餾水、(水葫蘆、狐尾藻、水葫蘆+狐尾藻)人工濕地、LB培養(yǎng)基中的E.coli O157:H7(Dox~RKan~S);養(yǎng)豬場(chǎng)排污渠(中游)、最大持水量狀態(tài)有機(jī)肥(含水量57%)、10 g有機(jī)肥+1 L蒸餾水、(水葫蘆、水葫蘆+狐尾藻、無植物)人工濕地、LB培養(yǎng)基中的TR-M30-1(Dox~SKan~R)。(5)完全培養(yǎng)基(LB)、養(yǎng)豬場(chǎng)排污渠不同地段、不同濃度的有機(jī)肥浸出液及人工濕地系統(tǒng)中E.coli O157:H7(Dox~RKan~S)、TR-M30-1(Dox~SKan~R)共培養(yǎng)3 d時(shí)的接合效率高低順序?yàn)?LB培養(yǎng)基(3.25×10~(-6))養(yǎng)豬場(chǎng)排污渠上游(1.124×10~(-6))養(yǎng)豬場(chǎng)排污渠中游(9.03×10~(-7))最大持水量狀態(tài)有機(jī)肥(含水量57%)(6.23×10~(-9))人工濕地系統(tǒng)(0)。(6)E.coli O157:H7(Dox~RKan~S)、TR-M30-1(Dox~SKan~R)共培養(yǎng)3 d時(shí)的接合效率和水質(zhì)相關(guān)因素的Pearson相關(guān)性分析顯示:pH值與接合效率呈顯著負(fù)相關(guān)性(p0.05);化學(xué)需氧量(COD)與接合效率呈顯著正相關(guān)性(p0.05);氨基酸含量與接合效率呈極顯著正相關(guān)性(p0.01);接合效率與總糖、還原糖、凱氏氮、總磷(TP)、有效磷等無顯著相關(guān)性。(7)狐尾藻、水葫蘆、狐尾藻+水葫蘆和無植物空白對(duì)照組人工濕地對(duì)COD_(cr)平均去除率分別為:38.82%、34.1%、32.37%和40.75%。
【圖文】：

大腸埃希菌1（DoxRKanS）藥敏篩選結(jié)果圖

TR-M30-1（DoxSKanR）藥敏篩選結(jié)果圖
【學(xué)位授予單位】：廣西師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：X52

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本文編號(hào)：2655446