發(fā)布時間：2020-05-05 19:24

【摘要】：菲律賓蛤仔黏附污泥(Ruditapes philippinarum conglutination mud,RPM)是菲律賓蛤仔水產(chǎn)養(yǎng)殖的典型副產(chǎn)品廢物,而舟山水產(chǎn)養(yǎng)殖場的RPM被新近報道為一種有前景的天然生物絮凝劑資源。旨在弄清楚RPM絮凝活性是否具有地域依賴性以及探索絮凝產(chǎn)生原因以拓寬其開發(fā)范圍,本研究對RPM的絮凝劑產(chǎn)生源及其分離的絮凝活性菌株進(jìn)行了系統(tǒng)性研究。來自大連、威海、舟山和湛江四個地點(diǎn)的RPM具有絮凝活性,其冷凍RPM樣品絮凝率在8 g/L達(dá)到最高(61.9±2.4%至73.2±0.9%),新鮮RPM樣品絮凝率最高達(dá)到91.34±1.18%,表明RPM的絮凝活性是廣泛存在的。將不同地點(diǎn)的RPM樣品進(jìn)行粗多糖和多樣性分析,結(jié)果表明地域差異性導(dǎo)致RPM細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多糖組成的差異,而細(xì)菌群落產(chǎn)生的多糖可能是RPM的絮凝活性基礎(chǔ)。所有樣品中的重疊OTUs占總序列44.6-62.22%,TOP 25屬均為重疊OTUs,TOP 50里82%為重疊OTUs,這些OTUs可能是RPM里負(fù)責(zé)產(chǎn)生絮凝劑和承擔(dān)絮凝活性的“核心基因組”。細(xì)菌的抑制生長顯著降低RPM的脫色率,真菌的抑制無顯著性變化,而胞外多糖可能是RPM絮凝活性主要承擔(dān)者,表明RPM里細(xì)菌群落直接影響多糖組分和脫色率。黃桿菌科(Flavobacteriaceae)的成員可能是RPM絮凝活性的主要貢獻(xiàn)者,如Lutibacter(3.99-16.13%),Maribacter(4.77-15.13%)。低豐度群落在決定RPM群落結(jié)構(gòu)中可能起重要作用,高豐度群落反而辨識度不高,這些群落結(jié)構(gòu)間的生態(tài)環(huán)境功能未來仍需進(jìn)一步研究。從RPM中分離獲得兩株高絮凝活性菌株JP和GHS18,絮凝率分別為80.0%、75.1%。綜合16S rDNA序列比對和生理生化結(jié)果,菌株JP和GHS18分別別被鑒定為Pseudoalteromonas undina和P.paragorgicola。對菌株JP和GHS18進(jìn)行基因組框架掃描和基因預(yù)測,分別預(yù)測到3746、4342個基因,14個rRNA/87個tRNA、11個rRNA/94個tRNA。將預(yù)測的基因注釋到數(shù)據(jù)庫COG、GO、KEGG、NR和Swiss-Prot中,在兩株菌株基因組中均發(fā)現(xiàn)了具有絮凝活性的胞外聚合物合成途徑中前體底物基因(UDP-Glucose、GDP-mannose和UDP-glucuronate等)和重復(fù)寡糖單元基因(UDP-Gal、dNTP-D-Glu、dNTP-L-Rham和UDP-ManNAcA等),然而將重復(fù)寡糖單元聚合成多糖的eps基因簇并未發(fā)現(xiàn),推測其具有類似的基因簇代替行使功能。本研究揭示了RPM共附生細(xì)菌承擔(dān)了主要的絮凝活性,是RPM絮凝劑產(chǎn)生源,為未來開發(fā)RPM及其共附生絮凝活性菌株為發(fā)酵產(chǎn)品提供了一定的理論依據(jù),以及對絮凝活性菌株的產(chǎn)絮凝劑生物合成途徑更進(jìn)一步的基因調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 2-1 中國四大海域的代表性采樣點(diǎn)地理位置Fig. 2-1 The R. philippinarum sampling locations along China coasts 樣品絮凝率測定性測定方法在 Mu 等（2018）使用高嶺土懸浮液法測定基礎(chǔ)上進(jìn)行60]。取 93 mL 4 g/L 高嶺土懸浮液，5 mL 10 g/L 氯化鈣溶液和 2 mL 泥樣品依次添加于 250 mL 燒杯中。菲律賓蛤仔黏附污泥樣品濃度8、10、15 g/L。所有溶液均用人工海水替代參照方法里的去離子水加 2.0 mol/L 鹽酸溶液或 2.0 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH 值至 7.5，拌混合液 1 min，然后以 80 rpm 緩慢攪拌混合液 2 min。靜置 10 分便攜式可見分光光度計在 550 nm 吸光度下進(jìn)行光密度（OD）值測 2 mL 人工海水替代 2 mL 菲律賓蛤仔黏附污泥樣品進(jìn)行 OD 值測三次平行樣測定。絮凝率（FR，F(xiàn)locculation rate）計算公式為：FR (%)=A-BA×100B 為分別為對照組和 RPM 樣品組在 550 nm 吸光度下的 OD 值。

中國四大海域采集的菲律賓蛤仔黏附污泥冷凍泥樣絮凝率（A）和舟山采樣點(diǎn)的黏附泥冷凍處理前后絮凝率（B）-2 The flocculation activity of freezing-treated RPM from four China coastal locations (A), afresh RPM and freezing-treated RPM from Zhoushan location (B)不同地點(diǎn) RPM 樣品粗多糖成分比較分析糖含量制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 2-3 所示，表明在一定的葡萄糖溶液濃，本實(shí)驗(yàn)所用的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的 OD 值與其濃度成線性關(guān)系，R2= 0.998，，，因此可用于測定待測樣品的總糖含量。y = 0.5909x + 0.0224R2= 0.9980.20.30.40.50.60.7光密度值（OD490nm)
【學(xué)位授予單位】：浙江海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：X714

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本文編號：2650636