發(fā)布時間：2020-04-22 01:07

【摘要】：PM_(2.5)是指環(huán)境空氣中空氣動力學(xué)直徑≤2.5μm的細顆粒物,可以較長時間在空氣中懸浮,因其粒徑小,比表面積大,活性較強,易附帶有毒、有害物質(zhì),并且容易被吸入沉淀到肺泡當(dāng)中,對肺部產(chǎn)生很大的影響,損害人類的健康。本實驗采用體外暴露的實驗方法探討杭州城區(qū)大氣PM_(2.5)對RAW264.7細胞的毒性作用及機制,主要結(jié)果如下:(1)經(jīng)過索氏提取和GC-MS測定PM_(2.5)中有機物各組分的含量,利用質(zhì)譜檢測PM_(2.5)中金屬元素的含量以確定顆粒物的主要成分,杭州城區(qū)大氣中的PM_(2.5)的主要有機成分是正構(gòu)烷烴、多環(huán)芳烴(PAHs)和磷酸二甲苯(PAEs),其中正構(gòu)烷烴含量最多約占總體的40%。金屬元素主要研究了Al,Cr,Mn,Fe,Ni,Cu,Zn,As,Cd,Pb,其中Zn的含量最多。從實驗結(jié)果可以說明,正構(gòu)烷烴和Zn是有機污染物和重金屬污染物含量最多的種類,同時也可推測杭州PM_(2.5)的來源主要是化石燃料的燃燒和生物質(zhì)的揮發(fā)。(2)將不同濃度的PM_(2.5)和RAW264.7細胞共培養(yǎng)24 h,使用倒置顯微鏡、熒光顯微鏡以及透射電鏡下觀察細胞表面、細胞器損傷以及ROS分布,可以發(fā)現(xiàn)暴露后的細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,細胞破碎,細胞膜邊緣不明顯并且細胞器中有空泡產(chǎn)生。ROS分布隨著暴露濃度的增高綠色熒光明顯增多。由此可以得出結(jié)論PM_(2.5)可以使細胞形態(tài)發(fā)生變化,并影響細胞產(chǎn)生氧化損傷。(3)采用不同濃度的PM_(2.5)和RAW264.7細胞共培養(yǎng)24 h,使用MTT法檢測細胞的存活率,流式細胞儀檢測細胞凋亡率、周期的變化以及線粒體膜電位情況,然后測定細胞內(nèi)NO漏出量和ELISA法檢測免疫相關(guān)蛋白TNF-α、IL-1、IL-6的生成變化。MTT法測得細胞存活率顯著下降,達到最大暴露濃度(800μg/mL)時,細胞活力僅為47%。流式細胞儀結(jié)果顯示細胞凋亡增加,同樣的達到暴露濃度(400μg/mL)時,細胞早期凋亡率為14.7%,晚期凋亡率為5.2%,但是細胞周期和線粒體膜電位未發(fā)生明顯的變化,免疫相關(guān)因子TNF-α、IL-1、IL-6生成量增多,NO漏出量也增多,說明PM_(2.5)對細胞產(chǎn)生較大的毒性作用,并且通過對細胞產(chǎn)生氧化損傷和炎癥損傷使細胞發(fā)生凋亡。(4)采用不同濃度的PM_(2.5)和RAW264.7細胞共培養(yǎng)24h,收集細胞,使用熒光定量PCR在分子水平上檢測凋亡相關(guān)基因Bax,Bcl-2,P53和氧化應(yīng)激相關(guān)基因Sod1,Sod2,Gpx1,Gpx2,INOs和Cat的表達情況,以確定細胞發(fā)生凋亡的途徑和抗氧化失調(diào)途徑。凋亡基因P53和Bax表達均上調(diào),Bcl-2表達下調(diào)。氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達也有相應(yīng)的變化,表達均上調(diào)。說明PM_(2.5)對細胞的毒性損傷在分子水平上都有較顯著的影響,抗氧化劑活性有所降低,并且作用在P53凋亡通路上使P53凋亡通路上基因也發(fā)生了顯著地變化。(5)為了進一步尋找更多PM_(2.5)致細胞產(chǎn)生毒性的代謝途徑,本文使用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)利用大數(shù)據(jù)平臺富集細胞發(fā)生變化的代謝途徑的通路,結(jié)果表明,20個差異基因表達上調(diào),涉及了PI3K-Akt信號途徑、NOD-like受體信號途徑、Jak-STAT信號途徑、TNF信號途徑、谷胱甘肽代謝途徑、DNA-sensing信號途徑、礦物質(zhì)吸收途徑、血管收縮系統(tǒng)、一氧化氮代謝途徑、NF-kappa B信號途徑等多種代謝途徑,說明細胞在多個代謝通路上影響了細胞生理活動,致細胞發(fā)生氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和凋亡。綜上所述,通過ROS生成增多,細胞活力減少、凋亡基因Bax,Bcl-2,P53和氧化應(yīng)激基因Sod1,Sod2,Gpx1,Gpx2,INOs和Cat的表達變化和炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6的釋放量增多,可以說明PM_(2.5)對細胞產(chǎn)生了較大的毒性作用,毒性機理涉及NOD-like受體信號途徑和Jak-STAT信號途徑等多個代謝通路。
【圖文】：

圖 2-1 PM2.5 樣品Fig.2-1 The sample of PM2.5 有機污染物含量測定結(jié)果2 可以看出，，PM2.5中的有機污染物有三大主要的類甲酸酯和正構(gòu)烷烴。其中正構(gòu)烷烴含量最高，正構(gòu)烷物，其中 13c 的含量最高，約占 10%，如圖 2-3 所示究中如圖 2-4，發(fā)現(xiàn) DEHP 的含量最高占 3.7%，跟生活關(guān)。多環(huán)芳烴中 BbF 和 Bghip 的含量也相對較高，約占

圖 3-2 不同濃度暴露下細胞電鏡圖Fig.3-2 Electron microscope of cell.3 MTT 結(jié)果為了明確 PM2.5 對巨噬細胞產(chǎn)生毒性作用，本實驗用 MTT 法檢測暴露胞存活率，由圖 3-3 可以看出細胞在經(jīng)受 PM2.5 暴露 24 小時后的存活率露濃度的增高而顯著降低。并且在最高濃度時，細胞的存活率僅僅為 46%出半數(shù)致死量為 721.329 μg/mL，為后續(xù)實驗濃度的篩選做準(zhǔn)備。實驗結(jié)果2.5 對巨噬細胞有很大的毒性作用，并呈現(xiàn)濃度-效應(yīng)關(guān)系。
【學(xué)位授予單位】：浙江工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R994.6;X513

【參考文獻】

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本文編號：2635952