【摘要】：活的但非可培養(yǎng)(viable but non-culturable,VBNC)狀態(tài)因其分布廣、易復(fù)蘇的特性在微生物資源領(lǐng)域廣受關(guān)注。多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls,PCBs)組成復(fù)雜,性質(zhì)穩(wěn)定是一種分布廣泛的持久性有機(jī)污染物,生物降解PCBs技術(shù)是備受關(guān)注的研究熱點(diǎn),獲得高效的PCBs降解菌則是研究的關(guān)鍵。然而通過普通培養(yǎng)方法獲得細(xì)菌限制了篩選PCBs降解菌的能力,研究VBNC狀態(tài)的功能菌將打開研究的新局面。本論文首先利用中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析法優(yōu)化復(fù)蘇VBNC狀態(tài)菌的復(fù)蘇促進(jìn)因子(resuscitation promoting factor,Rpf)的制備條件;以Aroclor 1242作為碳源,利用富集馴化培養(yǎng)法聯(lián)合16S rDNA高通量測序技術(shù)探究了Rpf對污染土壤中菌群活性以及結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響;利用最大或然數(shù)法(most probable number,MPN)法分離培養(yǎng)VBNC狀態(tài)菌,另外,以3,3',4,4'-四氯聯(lián)苯(3,3',4,4'-tetrachlorobiphenyl,PCB 77)為底物,利用實(shí)時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)技術(shù)研究bphA基因的表達(dá);同時,以PCB 77為研究對象探究了高效PCBs降解菌的生長情況、降解動力學(xué),通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)對中間代謝產(chǎn)物進(jìn)行了探究。獲得如下研究結(jié)果:(1)利用Design-Expert軟件通過中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析法獲得Rpf制備的最優(yōu)條件為:異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)的終濃度為33.9 mg/L、誘導(dǎo)細(xì)菌濃度即OD_(600)為0.4、誘導(dǎo)溫度為20.3℃以及誘導(dǎo)時間為7.0 h。通過重復(fù)性實(shí)驗(yàn)對模型的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證,為Rpf作為生物修復(fù)助劑的推廣和應(yīng)用奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。(2)在相同的Aroclor 1242濃度下,添加Rpf能有效的提高培養(yǎng)液中菌群的活性。當(dāng)Aroclor 1242濃度的升高至100 mg/L時Rpf效果最顯著,而隨后Rpf效果降低,至200 mg/L時,Rpf復(fù)蘇效果受限,處理組與對照組差別不明顯。16S rDNA高通量測序技術(shù)分析結(jié)果表明Rpf能夠有效改善功能菌群的多樣性。Sphingomonas屬、Pseudomonas屬和Burkholderia屬的細(xì)菌常作為PCBs轉(zhuǎn)化劑,在添加Rpf后其相對豐度均有增加;從不同分類學(xué)水平上對菌群結(jié)構(gòu)觀察,Proteobacteria是對Rpf添加敏感最主要的門,該門中Alphaproteobacteria綱和Betaproteobacteria綱,以及屬于Gammaproteobacteria綱的Pseudomonadaceae科中的大多數(shù)細(xì)菌具有PCBs降解效果。(3)成功分離復(fù)蘇23株功能菌,其中Castellaniella sp.SPC4表現(xiàn)出優(yōu)秀的PCB 77降解效果(50 mg/L PCB 77濃度下,降解率在兩天的時間內(nèi)超過40%)并檢測出bphA基因的存在。bphA基因在Castellaniella sp.SPC4代謝PCB 77過程中表達(dá)數(shù)是一個上調(diào)的趨勢,證實(shí)該過程有bphA基因的參與。(4)在不同PCB 77濃度下,Castellaniella sp.SPC4細(xì)菌生長情況和對PCB77的降解率表明該體系中只存在底物抑制并無產(chǎn)物抑制情況。Castellaniella sp.SPC4代謝PCB 77過程符合一級反應(yīng)速率方程,同時構(gòu)建PCB 77的微生物降解的動力學(xué)模型,該模型與Edward模型相匹配,擬合優(yōu)度R~2為0.8055,最大比降解速率q_(max)為0.9315 1/h,底物親和常數(shù)K_S為11.33 mg/L,底物抑制常數(shù)K_I為11.41 mg/L。另外,在Castellaniella sp.SPC4降解PCB 77過程中檢測到氯代苯甲酸和有氯取代的2-羥基-6-氧代-6-苯基六-2,4-二烯酸(2-hydroxy-6-oxo-6-phenylhexa-2,4-dienoic acid,HOPDA)的存在,為PCB 77降解進(jìn)行討論。本研究探明藤黃球菌Rpf制備的優(yōu)化條件為其有望成為生物修復(fù)助劑的推廣和使用提供物質(zhì)基礎(chǔ);考察了藤黃球菌Rpf促進(jìn)PCBs降解菌群活性和改善菌群多樣性的能力,為其作為一種生物修復(fù)助劑提供了理論基礎(chǔ)。成功復(fù)蘇分離VBNC狀態(tài)的高效功能菌,將探索各種高效功能菌群的范圍從常規(guī)可培養(yǎng)細(xì)菌擴(kuò)寬到不可培養(yǎng)的領(lǐng)域。討論了PCB 77降解過程中的降解動力學(xué),為持久性有機(jī)污染物尤其是多氯聯(lián)苯的生物修復(fù)技術(shù)的推廣和應(yīng)用提供理論支撐。
【圖文】：

圖 1.1 細(xì)胞 VBNC 狀態(tài)的形成及復(fù)蘇機(jī)制示意圖Figure 1.1 Schematic diagram of mechanism of formation and resuscitation of VBNC cells圖 1.2中37菌株歸類于：Proteobacteria、Actinobacteria和Firmicutes3個門；及 Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Actinobacteria和 Bacilli 5 個菌綱。其中，歸屬于 Gammaproteobacteria 的 Pseudomonas 屬及Actinobacteria 菌綱的 Rhodococcus 屬等在生物修復(fù)領(lǐng)域具有重要的意義。如Vaidya 等[87]報 道 了 Pseudomonas sp. ASDP1、Burkholderia sp. ASDP2 和Rhodococcus sp. ASDP3 這三株菌聯(lián)合培養(yǎng)可降解高分子量的多環(huán)芳烴芘。關(guān)于Rhodococcus ruber 9C 的生物脫硫功能被 Mishra 等[88]報道。Carvajal 等[89]也報道了 Rhodococcus 屬的細(xì)菌生物脫硫的應(yīng)用。Su 等[86, 90]報道 Rhodococcus 及Pseudomonas 屬的菌群生長可由 Rpf 促進(jìn)。分析圖 1.2，由 Rpf 復(fù)蘇得到的細(xì)菌不僅包括高 G+C 革蘭氏陽性菌更有低

11球菌 Rpf 復(fù)蘇分離所得菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹 圖示自展值（n=1000）均大于外源菌為：Esherichia coli Phylogenetic analysis of bacteria resuscitated by Rpf of Micrococcus luteus baNA gene sequences. Bootstrap values (n=1000) of above 50% are shown at theEsherichia coli was used as an outgroup內(nèi)容、目的及意義究以 PCBs 污染土壤中的 VBNC 菌群為研究對象，，開展?jié)撛诠δ芫捌浣到馓匦缘难芯�。主要研究�?nèi)容包括以下 4 部分：藤黃球菌 Rpf 制備與優(yōu)化中心組合設(shè)計(jì)思想設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，利用 Design-Expert 軟件由二次多項(xiàng)得多元回歸方程，通過有限次的實(shí)驗(yàn)對 Rpf 的產(chǎn)量進(jìn)行分析優(yōu)化
【學(xué)位授予單位】：浙江師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：X172;X592

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5 趙U

本文編號：2618464