【摘要】：近年來由于雌激素等內分泌干擾物對人類健康和生態(tài)安全造成了嚴重的威脅,逐漸引起國內外學者的廣泛關注,并對其在自然環(huán)境中的污染水平、富集程度、遷移方式和轉化過程等進行深入研究。生物修復法即利用微生物降解環(huán)境雌激是解決雌激素污染的有效方法之一。闡明雌激素降解微生物的基因組結構與特性是利用微生物代謝能力進行環(huán)境雌激素降解的基礎和前提。本文以17β-雌二醇(E2)為目標污染物,篩選獲得1株具有E2高效降解能力的紅球菌,并對其基因組結構特征、降解酶基因分布和表達特征進行研究,同時與其他紅球菌基因組進行比較分析,為今后雌激素降解工程菌的構建奠定了基礎。1.雌激素降解菌的篩選與鑒定以雌二醇為唯一碳源篩選出一株雌二醇高效降解菌株,使用酶標儀和高效液相色譜法測定菌株生長曲線和雌二醇的剩余量,通過觀察發(fā)現(xiàn)菌株能夠很好的生長和利用雌二醇,在第三天雌二醇降解率達到最高97%,在第五天時OD600值達到了0.155。對菌株進行形態(tài)學觀察、生理生化分析和16S rDNA的序列分析與鑒定,結果表明,該菌株為放線菌門,放線菌綱,紅球菌屬馬紅球菌。命名為Rhodococcus.DSSKP-R-001(簡稱RD1)。保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)。2.紅球菌DSSKP-R-001的全基因組測序及功能基因注釋利用第二代、第三代測序技術對Rhodococcus.DSSKP-R-001進行全基因組測序和功能基因的注釋�；蚪M草圖序列包括基因組大小約為5.4 Mbp、G+C含量為68.72%,以及含有5180個預測蛋白質編碼基因。菌株Rhodococcus.DSSKP-R-001基因組由三個復制子構成,一個染色體和兩個質粒。染色體大小為5.2 Mbp,兩個質粒分別為0.09 Mbp和0.09Mbp。使用COG、GO、KEGG和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫分別注釋到3736個基因、3472個基因、2590個基因和1932個基因。通過功能基因注釋,結果顯示共得到10種與雌激素降解酶主要相關的基因,且各種酶基因在整個序列中具有廣泛分布和不等的重復出現(xiàn)的特征。3.雌激素降解酶的驗證與表達通過聚合酶鏈式反應(PCR)和逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)對雌二醇降解酶的存在及表達進行了驗證,共發(fā)現(xiàn)十種直接參與類固醇降解的酶,即3α-羥基類固醇脫氫酶、3-酮類固醇-Δ1-脫氫酶、乙醛脫氫酶、膽固醇氧化酶、3-酮類固醇-9α羥化酶、雙加氧酶、3,4-DHSA雙加氧酶、單加氧酶、乙酰輔酶A乙酰轉移酶、3-酮�；o酶A硫解酶,同時,其中有四種酶3-酮類固醇-9α羥化酶、單加氧酶、雙加氧酶、乙醛脫氫酶進行了mRNA的表達。4.基因組比較分析運用比較基因組學方法將Rhodococcus.DSSKP-R-001與Rhodococcus.sp.P14、Rhodococcus jostii.RHA1、Rhodococcus opacus B4進行二維共線性、平行共線性以及Venn圖比較分析,發(fā)現(xiàn)Rhodococcus.DSSKP-R-001與Rhodococcus.sp.P14相似性最高,與Rhodococcus.sp.P14、Rhodococcus jostii.RHA1、Rhodococcus opacus B4和Rhodococcus equi 103S共有的基因有2070個,其中1159個基因參與物質代謝,菌株之間表現(xiàn)出進化的同源性。
【圖文】：

3 雌二醇為唯一碳源 Rhodococcus.DSSKP-R-001 的生長曲線和降解曲 Growth curve and degradation curve of Rhodococcus.DSSKP-R-001 arce for estradiol結 株 E2 高效降解菌株，對 50 mg/L 的 E2 降解率較高，在第三形態(tài)學分析，菌落形態(tài)呈圓形、微凸、表面光滑、菌體黃色，在電鏡下觀察菌株形態(tài)呈球狀，無鞭毛，以上特征均符合過構建菌株序列系統(tǒng)發(fā)育樹可確定這株菌株屬于 Rhodococc，命名為 Rhodococcus.DSSKP-R-001，保藏于中國普通微生。

C圖 3-1 紅球菌菌株 Rhodococcus.DSSKP-R-001 全基因組圖譜A：染色體；B：質粒 1；C: 質粒 2e 3-1 Genome-wide map of Rhodococcus.DSSKP-R-001 strain of RhodoA: chromosome; B: Plasmid 1; C: Plasmid 2hodococcus.DSSKP-R-001 的基因組注釋結果更加全面認識 DSSKP-R-001 基因結構與特征，并且針對全基因，我們選取微生物基因組最主要的 COG、GO 和 KEGG 三個數(shù)據(jù)分析。COG，對外公開且應用廣泛，是由 NCBI 創(chuàng)建并進行維護蛋白質的構建依據(jù)真核生物、藻類、和細菌的完整編碼蛋白系統(tǒng)的進序得到的蛋白序列比對 COG 中，，進而可推測該序列的相關功能結果：RNA 加工和修飾（A）、染色質結構和動力學（B）、能、控制細胞周期、分裂，染色體的分配（D）、參與氨基酸轉苷酸轉運以及代謝（F）、碳水化合物運輸代謝（G）、參與
【學位授予單位】：東北師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：X172;Q933

【參考文獻】

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本文編號：2618210