【摘要】：近年來由于雌激素等內(nèi)分泌干擾物對人類健康和生態(tài)安全造成了嚴(yán)重的威脅,逐漸引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注,并對其在自然環(huán)境中的污染水平、富集程度、遷移方式和轉(zhuǎn)化過程等進(jìn)行深入研究。生物修復(fù)法即利用微生物降解環(huán)境雌激是解決雌激素污染的有效方法之一。闡明雌激素降解微生物的基因組結(jié)構(gòu)與特性是利用微生物代謝能力進(jìn)行環(huán)境雌激素降解的基礎(chǔ)和前提。本文以17β-雌二醇(E2)為目標(biāo)污染物,篩選獲得1株具有E2高效降解能力的紅球菌,并對其基因組結(jié)構(gòu)特征、降解酶基因分布和表達(dá)特征進(jìn)行研究,同時(shí)與其他紅球菌基因組進(jìn)行比較分析,為今后雌激素降解工程菌的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。1.雌激素降解菌的篩選與鑒定以雌二醇為唯一碳源篩選出一株雌二醇高效降解菌株,使用酶標(biāo)儀和高效液相色譜法測定菌株生長曲線和雌二醇的剩余量,通過觀察發(fā)現(xiàn)菌株能夠很好的生長和利用雌二醇,在第三天雌二醇降解率達(dá)到最高97%,在第五天時(shí)OD600值達(dá)到了0.155。對菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化分析和16S rDNA的序列分析與鑒定,結(jié)果表明,該菌株為放線菌門,放線菌綱,紅球菌屬馬紅球菌。命名為Rhodococcus.DSSKP-R-001(簡稱RD1)。保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)。2.紅球菌DSSKP-R-001的全基因組測序及功能基因注釋利用第二代、第三代測序技術(shù)對Rhodococcus.DSSKP-R-001進(jìn)行全基因組測序和功能基因的注釋。基因組草圖序列包括基因組大小約為5.4 Mbp、G+C含量為68.72%,以及含有5180個(gè)預(yù)測蛋白質(zhì)編碼基因。菌株Rhodococcus.DSSKP-R-001基因組由三個(gè)復(fù)制子構(gòu)成,一個(gè)染色體和兩個(gè)質(zhì)粒。染色體大小為5.2 Mbp,兩個(gè)質(zhì)粒分別為0.09 Mbp和0.09Mbp。使用COG、GO、KEGG和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫分別注釋到3736個(gè)基因、3472個(gè)基因、2590個(gè)基因和1932個(gè)基因。通過功能基因注釋,結(jié)果顯示共得到10種與雌激素降解酶主要相關(guān)的基因,且各種酶基因在整個(gè)序列中具有廣泛分布和不等的重復(fù)出現(xiàn)的特征。3.雌激素降解酶的驗(yàn)證與表達(dá)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)對雌二醇降解酶的存在及表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證,共發(fā)現(xiàn)十種直接參與類固醇降解的酶,即3α-羥基類固醇脫氫酶、3-酮類固醇-Δ1-脫氫酶、乙醛脫氫酶、膽固醇氧化酶、3-酮類固醇-9α羥化酶、雙加氧酶、3,4-DHSA雙加氧酶、單加氧酶、乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶、3-酮�；o酶A硫解酶,同時(shí),其中有四種酶3-酮類固醇-9α羥化酶、單加氧酶、雙加氧酶、乙醛脫氫酶進(jìn)行了mRNA的表達(dá)。4.基因組比較分析運(yùn)用比較基因組學(xué)方法將Rhodococcus.DSSKP-R-001與Rhodococcus.sp.P14、Rhodococcus jostii.RHA1、Rhodococcus opacus B4進(jìn)行二維共線性、平行共線性以及Venn圖比較分析,發(fā)現(xiàn)Rhodococcus.DSSKP-R-001與Rhodococcus.sp.P14相似性最高,與Rhodococcus.sp.P14、Rhodococcus jostii.RHA1、Rhodococcus opacus B4和Rhodococcus equi 103S共有的基因有2070個(gè),其中1159個(gè)基因參與物質(zhì)代謝,菌株之間表現(xiàn)出進(jìn)化的同源性。
【圖文】：

3 雌二醇為唯一碳源 Rhodococcus.DSSKP-R-001 的生長曲線和降解曲 Growth curve and degradation curve of Rhodococcus.DSSKP-R-001 arce for estradiol結(jié) 株 E2 高效降解菌株，對 50 mg/L 的 E2 降解率較高，在第三形態(tài)學(xué)分析，菌落形態(tài)呈圓形、微凸、表面光滑、菌體黃色，在電鏡下觀察菌株形態(tài)呈球狀，無鞭毛，以上特征均符合過構(gòu)建菌株序列系統(tǒng)發(fā)育樹可確定這株菌株屬于 Rhodococc，命名為 Rhodococcus.DSSKP-R-001，保藏于中國普通微生。

C圖 3-1 紅球菌菌株 Rhodococcus.DSSKP-R-001 全基因組圖譜A：染色體；B：質(zhì)粒 1；C: 質(zhì)粒 2e 3-1 Genome-wide map of Rhodococcus.DSSKP-R-001 strain of RhodoA: chromosome; B: Plasmid 1; C: Plasmid 2hodococcus.DSSKP-R-001 的基因組注釋結(jié)果更加全面認(rèn)識 DSSKP-R-001 基因結(jié)構(gòu)與特征，并且針對全基因，我們選取微生物基因組最主要的 COG、GO 和 KEGG 三個(gè)數(shù)據(jù)分析。COG，對外公開且應(yīng)用廣泛，是由 NCBI 創(chuàng)建并進(jìn)行維護(hù)蛋白質(zhì)的構(gòu)建依據(jù)真核生物、藻類、和細(xì)菌的完整編碼蛋白系統(tǒng)的進(jìn)序得到的蛋白序列比對 COG 中，，進(jìn)而可推測該序列的相關(guān)功能結(jié)果：RNA 加工和修飾（A）、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)（B）、能、控制細(xì)胞周期、分裂，染色體的分配（D）、參與氨基酸轉(zhuǎn)苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)以及代謝（F）、碳水化合物運(yùn)輸代謝（G）、參與
【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：X172;Q933

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 馬蓉;張立軍;丁銳;敖永華;胡紫菱;劉姍;;大腸桿菌氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究進(jìn)展[J];科技通報(bào);2012年03期

2 陳文翔;王蘊(yùn)峗;謝國建;章佳;張家煒;;17β-雌二醇的污染治理技術(shù)研究進(jìn)展[J];環(huán)境科學(xué)導(dǎo)刊;2008年06期

3 謝國建;姜理英;陳建孟;;17β-雌二醇的危害及其環(huán)境行為研究[J];土壤通報(bào);2008年01期

4 宋雪梅;李宏濱;杜立新;;比較基因組學(xué)及其應(yīng)用[J];生命的化學(xué);2006年05期

5 杜克久,徐曉白;環(huán)境雌激素研究進(jìn)展[J];科學(xué)通報(bào);2000年21期

本文編號：2618210