【摘要】：多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是分布廣、難降解的有機(jī)污染物,因疏水性強(qiáng)、毒性大、污染持久而受到越來(lái)越多的關(guān)注。熒蒽是4環(huán)的高分子量多環(huán)芳烴,在結(jié)構(gòu)上與咔唑、二VA英等類(lèi)似,是研究此類(lèi)型多環(huán)芳烴的模式化合物。本研究以銅綠假單胞菌DN1(Pseudomonas aeruginosa DN1)為出發(fā)菌株,綜合運(yùn)用基因組、轉(zhuǎn)錄組和基于色譜技術(shù)的代謝組分析等方法解析熒蒽降解的分子機(jī)制。首先采用Pac Bio RSII和Illumina Miseq結(jié)合的雙末端測(cè)序技術(shù)獲悉P.aeruginosa DN1的全基因組序列信息:全基因組是由6,959,251個(gè)堿基對(duì)(bp)組成,包括一個(gè)6,641,902bp的環(huán)形染色體(G+C含量67.09%)及一個(gè)317,349bp的質(zhì)粒(G+C含量57.01%);注釋到6,450個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因;運(yùn)用r RNAmmer、t RNAscan、Rfam從全基因組中獲得64個(gè)t RNAs和12個(gè)r RNAs。同時(shí),P.aeruginosa DN1的基因組中預(yù)測(cè)到了一百多種與PAHs降解相關(guān)的基因,其中25個(gè)雙加氧酶基因中包含了5個(gè)環(huán)羥基雙酶基因。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)P.aeruginosa DN1部分PAHs降解相關(guān)的基因發(fā)生了轉(zhuǎn)移或重排,Otho ANI比較分析結(jié)果顯示:P.aeruginosa DN1與同屬的其他菌株親緣關(guān)系較近,且與模式菌株P(guān)AO1具有較好的共線(xiàn)性。在全基因組測(cè)序及分析的基礎(chǔ)上,對(duì)熒蒽脅迫條件的P.aeruginosa DN1進(jìn)行了RNA-Seq測(cè)序及分析,探究以熒蒽為唯一碳源條件下參與熒蒽降解、調(diào)控及轉(zhuǎn)運(yùn)等相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示:熒蒽脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄組分析檢測(cè)到差異表達(dá)的基因數(shù)目為3,522個(gè),其中上調(diào)及下調(diào)的基因分別為1,919和1,603個(gè)。結(jié)合基因組數(shù)據(jù)分析,發(fā)現(xiàn)在碳代謝、芳香烴化合物降解及苯甲酸降解等途徑中存在大量差異表達(dá)的基因,其中熒蒽降解過(guò)程中關(guān)鍵酶基因cat A、pca G和pca H均呈明顯上調(diào)趨勢(shì)。為進(jìn)一步探究這些關(guān)鍵基因在熒蒽降解過(guò)程中的功能,利用同源重組技術(shù)對(duì)cat A、pca G和pca H進(jìn)行基因敲除。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:突變菌株在熒蒽、原兒茶酸和兒茶酚為唯一碳源時(shí)生長(zhǎng)情況受基因缺失的影響,而在葡萄糖中生長(zhǎng)無(wú)明顯差異;尤其是突變株Δpca G和Δcat A在分別以原兒茶酸和兒茶酚為唯一碳源時(shí)生長(zhǎng)更緩慢。同時(shí),三株突變菌株對(duì)熒蒽降解能力均受到影響,以基因pca G的缺失對(duì)熒蒽降解率的影響顯著。DN1菌株在以50μg/m L熒蒽為唯一碳源的MSM培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)9天,熒蒽降解率可以達(dá)到84.47%;而同等條件下突變菌株Δpca G降解率僅為64.3%。此外,pca H與pca G作為銅綠假單胞菌降解熒蒽過(guò)程中的關(guān)鍵基因,二者同為原兒茶酸-3,4-雙加氧酶的編碼基因,但Δpca H菌株的熒蒽降解率為71.67%,略高于Δpca G菌株。由此推測(cè),cat A、pca G、pca H等關(guān)鍵基因的敲除對(duì)熒蒽降解具有明顯的影響,但其缺失并不能完全抑制熒蒽降解。同時(shí),利用GC/MS色譜分析檢測(cè)到熒蒽降解的發(fā)酵液中不僅殘留有未降解的熒蒽,同時(shí)還檢測(cè)到了9-羥基芴、1-二羥苊酮、1,8-萘二甲酸酐及α/β-甲基萘和2,3-二甲基萘等物質(zhì)。由此推測(cè)菌株DN1降解熒蒽可能起始于C-7,8位點(diǎn)的雙加氧反應(yīng),但不排除該菌株通過(guò)C-1,2和/或C-2,3雙加氧途徑降解,詳細(xì)的降解途徑還有待進(jìn)一步研究。
【圖文】：

西北大學(xué)碩士學(xué)位論文， “三廢”排放量大，汽車(chē)等交通工具的尾氣排放，燒烤、烹飪等其他來(lái)源的15]。人類(lèi)活動(dòng)依然是海洋環(huán)境中的 PAHs 主要來(lái)源，同時(shí)也有生物代謝及地球化學(xué)然來(lái)源 PAHs：如微生物等的生物合成，火山噴發(fā)、森林火災(zāi)及海底沉積物的等。人類(lèi)活動(dòng)造成海洋環(huán)境中的 PAHs 污染的主要方式：石油加工、運(yùn)輸以及和工業(yè)“三廢”等最終會(huì)以地表徑流的形式匯至海洋環(huán)境。據(jù)報(bào)道，自然界 PA來(lái)源是物質(zhì)燃燒產(chǎn)生的 PAHs，這些有機(jī)化合物經(jīng)空氣傳輸，在世界范圍內(nèi)飄洋環(huán)境中的 PAHs 有 10-18%就是來(lái)自于大氣沉降[16, 17]。

第一章 緒論關(guān)。苯環(huán)數(shù)少的 LMW PAHs 通常會(huì)引發(fā)急性毒性，而苯環(huán)數(shù)傳性毒性[18, 19]。據(jù)報(bào)道， PAHs 代謝生成的二氫二醇環(huán)氧衍通過(guò)與 DNA 共價(jià)結(jié)合破壞復(fù)制過(guò)程，誘發(fā)癌癥的發(fā)生[20-22]。常具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性[23]。 通常具有化學(xué)致癌作用、光致毒和生物毒性�；瘜W(xué)致癌作用基因發(fā)生變異，誘發(fā)癌變的過(guò)程，目前，， PAHs 的化學(xué)致癌論”、“L 區(qū)理論”及“雙區(qū)理論”等[24]�！癒 區(qū)”和“L 區(qū)”分別指結(jié)構(gòu)。研究認(rèn)為帶有“K 區(qū)”和/或“L 區(qū)”結(jié)構(gòu) PAHs 具有致W PAHs 的生物毒性基于其穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)及較強(qiáng)的疏水性s 更容易進(jìn)行生物累積，通過(guò)食物鏈富集、擴(kuò)散，在生物體內(nèi)有的光致毒作用是指其在有氧時(shí)，尤其是紫外有氧條件下產(chǎn)破壞細(xì)胞膜，損傷生物大分子 DNA、蛋白質(zhì)。
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：X172;X505

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2601673