【摘要】：耐藥細(xì)菌所攜帶的耐藥基因可以通過質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等可移動元件傳遞給其它環(huán)境微生物,從而導(dǎo)致耐藥基因的傳播和擴散。目前對耐藥基因轉(zhuǎn)移機制的研究多集中在質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子,對噬菌體在耐藥基因傳播中的貢獻(xiàn)了解甚少。噬菌體是一類細(xì)菌病毒的總稱,是生態(tài)系統(tǒng)中豐度最高的生物,廣泛分布于湖泊、海洋、以及生物體內(nèi)等一切有微生物存在的地方。噬菌體在河流、海洋、污水等自然環(huán)境中介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移已經(jīng)被證實,其作為可移動元件在基因轉(zhuǎn)移和基因重組中的作用頻率比人們預(yù)想的要高。但是,目前對噬菌體基因組攜帶抗生素耐藥基因以及在抗生素耐藥基因水平傳播中的作用機制研究卻十分有限。本研究從城市污水處理廠分離得到一株多重耐藥細(xì)菌的噬菌體,對其生理生化性質(zhì)及全基因組進(jìn)行研究;隨后,我們又對新鄉(xiāng)市衛(wèi)河水體中細(xì)菌和噬菌體宏基因組中耐藥基因的種類和豐度進(jìn)行了研究;最后,我們通過實驗室模擬實驗研究了噬菌體在水體環(huán)境中耐藥基因水平轉(zhuǎn)移中的作用。獲得如下創(chuàng)新性成果:(1)從新鄉(xiāng)市駱駝灣城市污水處理廠分離獲得50株多重耐藥菌株,以此為宿主共分離到一株噬菌體YZ1,其宿主為Escherichia coli XX13(MG735731.1),該宿主對慶大霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素、四環(huán)素、阿莫西林-克拉維酸、萬古霉素、甲硝唑、頭孢噻肟均具有耐藥性。經(jīng)透射電鏡觀察,噬菌體YZ1為短尾科噬菌體,頭部直徑約為45 nm,尾部長度大約為3nm。噬菌體YZ1的最佳感染復(fù)數(shù)MOI=0.01,在0-40℃范圍內(nèi)其生物活性穩(wěn)定;在pH4.0-8.0之間噬菌體均可保持活性。一步生長曲線結(jié)果顯示,噬菌體YZ1潛伏期為20 min,裂解期約50min。YZ1為一線性雙鏈DNA分子,基因組全長38823bp,GC含量50.37%(GenBank登錄號為:MG845865)。NCBI比對結(jié)果表明噬菌體YZ1屬于T7 like噬菌體,噬菌體YZ1全基因組與E.coli phage K1F在結(jié)構(gòu)和序列上有95%相似性。所預(yù)測到的ORF序列經(jīng)NCBI比對(e-value10~(-5)),得到42個有功能注釋的ORF,其功能類型主要與DNA復(fù)制、噬菌體結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄以及溶原性相關(guān)。在基因組原始數(shù)據(jù)中有28段序列比對到了氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類等抗生素的耐藥基因。后續(xù)的熒光定量PCR結(jié)果顯示,噬菌體和宿主菌的DNA樣品中均含有aacC2、aac(6')-Ib、aadA、sul2、blaCTX-M耐藥基因,但tetT只在宿主菌中被檢測到。(2)選用250對耐藥基因引物利用高通量熒光定量PCR技術(shù)對衛(wèi)河水體MYH取樣點進(jìn)行細(xì)菌和噬菌體宏基因組上耐藥基因檢測,結(jié)果表明,噬菌體宏基因組上檢測到50個耐藥基因,包括氨基糖苷類9種、FCA類5種、β-內(nèi)酰胺類5種、MLSB類9種、萬古霉素類6種、四環(huán)素類4種、未知機制的12種;細(xì)菌宏基因組檢測到173對引物的耐藥基因,包括氨基糖苷類28種、FCA類20種、β-內(nèi)酰胺類35種、MLSB類16種、萬古霉素類9種、四環(huán)素類24種,磺胺類3種,插入序列7種,未知機制的31種�；谠摻Y(jié)果,利用qPCR技術(shù)對衛(wèi)河新鄉(xiāng)市市區(qū)段六個水體取樣點的噬菌體和細(xì)菌宏基因組進(jìn)行耐藥基因豐度研究,結(jié)果表明,tetX、ereA、aac(6')-Ib基因在六個取樣點的噬菌體和細(xì)菌的宏基因組中均檢測到,豐度分別為10~1-10~3copies/L和10~5-10~(10)copies/L,但是blaCTX-M1在MYH、WHB兩個取樣點的噬菌體宏基因組中并未檢出。(3)為了驗證噬菌體在耐藥基因轉(zhuǎn)移中的作用,構(gòu)建了實驗室無菌培養(yǎng)體系,在含120株分離自衛(wèi)河水體的混合細(xì)菌的4個培養(yǎng)器中分別加入3.6×10~6 pfu/ml噬菌體原液、抗生素(終濃度為2μg/ml四環(huán)素和2μg/ml阿奇霉素復(fù)合藥液)、噬菌體+抗生素、對照(無抗生素和噬菌體)。經(jīng)過連續(xù)20天培養(yǎng),各個培養(yǎng)器中耐四環(huán)素和耐阿奇霉素的菌株豐度均增加,添加噬菌體原液的反應(yīng)器中耐四環(huán)素和阿奇霉素的細(xì)菌豐度高于不加噬菌體原液的反應(yīng)器,約為對照反應(yīng)器的10倍,添加抗生素的反應(yīng)器中耐藥菌細(xì)菌的豐度也明顯上升;基因檢測表明,抗生素的加入對tet X、tetW、tetA、tetO、ereA、blaCTX-M、sul1基因有明顯的富集作用;噬菌體加入促進(jìn)了tetX、ereA、qnrA的富集,但并未促進(jìn)tetO、tetA、tetW、ermA、ermB、blaCTX-M、sul1、qnrA基因的富集。對培養(yǎng)20天的反應(yīng)器中細(xì)菌進(jìn)行高通量測序研究其中的細(xì)菌群落,結(jié)果表明,添加噬菌體的培養(yǎng)器中物種的多樣性明顯高于不加噬菌體的培養(yǎng)器。
【圖文】：

結(jié)果.1 多重耐藥細(xì)菌與噬菌體的分離本實驗共分離到 50 株多重耐藥菌株，以此 50 株菌作為宿主菌，利用雙層法分離噬菌體，，共得到一株噬菌體，宿主為大腸桿菌，命名為 Escher13(MG735731.1)，其對應(yīng)的噬菌體命名為 YZ13（MG845865），通過透射電知，噬菌體 YZ1 為短尾科噬菌體，頭部直徑大約為 45nm，尾部長度大約為-1。

圖 2-1 噬菌體 YZ13 噬菌斑及微觀形態(tài)2.4.2 宿主菌藥敏實驗藥敏實驗結(jié)果如圖 2-2 所示，該宿主對慶大霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素、四環(huán)素、阿莫西林-克拉維酸、萬古霉素、甲硝唑、頭孢噻肟均具有抗性。由此我們可以確定該菌株為多重耐藥菌株。
【學(xué)位授予單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：X703

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1 李文舒;龔書s

本文編號：2599684