【摘要】：全氟辛酸(PFOA)是一種典型的全氟有機(jī)化合物(PFCs),廣泛應(yīng)用于紡織、化工、機(jī)械、醫(yī)藥、電子和航空等領(lǐng)域。由于其具有持久性、生物積累性和生物毒性,近些年在各種環(huán)境介質(zhì)中被檢測(cè)到,嚴(yán)重威脅生態(tài)安全和人類健康。PFOA作為一種新型的持久性有機(jī)污染物,其修復(fù)治理成為環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一,而生物降解作為一種環(huán)境友好型、經(jīng)濟(jì)節(jié)約型修復(fù)技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究首先經(jīng)過富集培養(yǎng)和梯度馴化,從某氟化物工廠污染的土壤中分離獲得2株能以PFOA為唯一碳源生長(zhǎng)的真菌(編號(hào)為AF1和AF2)�；谛螒B(tài)特征和ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析,初步鑒定2株真菌分別屬于棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)和棘卷枝毛霉(Mucor circinelloides)。研究2株真菌的生長(zhǎng)特性發(fā)現(xiàn)菌株AF2具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì),最大生物量相比真菌AF1高;采用LC-MS測(cè)試這些株菌降解PFOA能力,結(jié)果表明真菌AF1和AF2在以PFOA為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中發(fā)酵96 h后,PFOA降解率最大,分別為23.24±1.26%和28.12±1.45%。接著,研究了優(yōu)勢(shì)降解菌AF2對(duì)PFOA耐受性和脅迫生理響應(yīng)。測(cè)定真菌AF2在PFOA濃度為0、1000、1500、2000 mg/L的PDB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況,發(fā)現(xiàn)其對(duì)PFOA耐受的最高濃度為1500 mg/L;菌株AF2的SOD、GSH活力,MDA含量隨著PFOA脅迫濃度(0、300、600 mg/L)的升高顯著增加,高濃度PFOA(900mg/L)的脅迫使MDA含量、SOD和GSH活力降低。結(jié)果表明菌株AF2具有較高的PFOA耐受性,但過高濃度的PFOA能對(duì)降解菌AF2產(chǎn)生氧化脅迫和膜損傷。以含有或未有PFOA的改良無機(jī)鹽培養(yǎng)基發(fā)酵真菌AF2,分別收集培養(yǎng)96 h和120 h的真菌菌體(即P96、C96、P120、C120四組),進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和比較轉(zhuǎn)錄組分析。通過數(shù)據(jù)的過濾和拼接組裝,共獲得5,8181條Unigene,總長(zhǎng)度為3854,1574 bp;轉(zhuǎn)錄本功能注釋發(fā)現(xiàn)有4,8731條Unigene能被注釋到各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中。通過處理組和對(duì)照組的差異表達(dá)基因分析,發(fā)現(xiàn)P96和C96比較組共有2000個(gè)差異基因,其中694個(gè)基因上調(diào)表達(dá),有1306個(gè)基因下調(diào)表達(dá);P120和C120比較組共有1244個(gè)差異基因,其中551個(gè)基因上調(diào)表達(dá),693個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。通過兩個(gè)比較組的差異基因注釋,發(fā)現(xiàn)16個(gè)共同的差異基因被注釋到異源物降解和代謝通路中,推測(cè)為真菌AF2降解PFOA相關(guān)的候選功能基因�？傊�,本研究首次分離獲得2株降解PFOA的真菌,其中真菌AF2為降解PFOA優(yōu)勢(shì)菌株;PFOA氧化脅迫測(cè)試發(fā)現(xiàn)降解菌AF2具有較高的PFOA耐受能力,推測(cè)是一株有較好降解PFOA潛能的微生物菌種。同時(shí),開展了兩種發(fā)酵條件下真菌AF2的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究,初步獲得16個(gè)與PFOA降解相關(guān)的候選基因。項(xiàng)目的開展為持久性有機(jī)污染物PFOA的微生物降解積累了種質(zhì)資源,為闡明微生物降解轉(zhuǎn)化PFOA的分子機(jī)制提供了科學(xué)數(shù)據(jù)。
【圖文】：

計(jì)算 PFOA 的降解率：R（%）=（P-T）/P 100%，其中 P 為 PFOA 初始濃度，T 為發(fā)酵一段時(shí)間后培養(yǎng)液中 PFOA 濃度。實(shí)驗(yàn)接種滅菌的種子液作為對(duì)照。2.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 3 次平均值 標(biāo)準(zhǔn)差，采用 origin 9.0 進(jìn)行圖表繪制。利用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。2.3 結(jié)果與分析2.3.1 降解菌株的分離鑒定經(jīng)過多輪富集培養(yǎng)和逐步馴化，我們從受氟化合物污染的土壤中篩選獲得 2株真菌，分標(biāo)編號(hào)為 AF1、AF2，它們能在僅有 PFOA 碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，表明能分解利用 PFOA 作為碳源和能源。將 2 株真菌分別接種于含 500 mg/L PFOA的 PDA 培養(yǎng)基平板培養(yǎng)，菌落形態(tài)如圖 2.1 所示，菌株 AF1 培養(yǎng) 3 d 后菌落覆蓋約 3/4 平板，菌苔呈白色、圓形、絨毛狀，培養(yǎng) 5 d 后菌落中心長(zhǎng)出綠色的孢子。菌株 AF2 培養(yǎng) 3 d 后菌落，菌苔呈淺灰色，圓形、絨毛狀；培養(yǎng) 5 d 后菌落中心長(zhǎng)出灰色孢子。A B

第 2 章 PFOA 降解菌的分離與鑒定以 2 株降解 PFOA 真菌基因組 DNA 為模板，利用 PCR 成功擴(kuò)增出 ITS 序列片段，PCR 產(chǎn)物測(cè)序和校對(duì)后進(jìn)行經(jīng)多重對(duì)比和聚類分析，構(gòu)建其與同源性較高典型菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖 2.2。真菌 AF1 與棘孢木霉（Trichoderma asperellumHQ589153.1）聚在一支，，其 ITS 序列同源性為 100%，結(jié)合菌落形態(tài)初步鑒定真菌AF1 為棘孢木霉菌（Trichoderma asperellum）；真菌 AF2 與棘卷枝毛霉（Mucorcircinelloides）的 ITS 序列 100%同源，聚在一個(gè)分支，結(jié)合菌落形態(tài)初步鑒定真菌 AF2 為棘卷枝毛霉（Mucor circinelloides）。
【學(xué)位授予單位】：吉首大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：X172;X505

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本文編號(hào)：2595302