【摘要】：撲草凈是一種廣譜的三嗪類長殘留除草劑,由于其大量頻繁使用對土壤和地下水造成了嚴(yán)重污染。微生物修復(fù)是其污染去除的重要手段,以阿特拉津?yàn)榇怼敖颉鳖惾侯惓輨┑奈⑸锝到馔緩脚c分子機(jī)理已有深入地研究,但以撲草凈為代表的“凈”類三嗪除草劑代謝途徑與功能基因研究相對較少。本論文以前期分離的一株撲草凈降解菌株Leucobacter triazinivorans sp JW-1為研究對象,在明確其降解撲草凈化學(xué)途徑基礎(chǔ)上,通過克隆撲草凈脫甲硫基基因,構(gòu)建大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng),His GraviTrap Co柱分離純化重組蛋白,開展其酶學(xué)性質(zhì)(溫度、pH、酶反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)和底物特異性)研究,主要研究結(jié)果如下:1.通過菌株JW-1質(zhì)粒測序和Blast比對分析,得到脫甲硫基可能基因序列大小為1371 bp,序列比對結(jié)果顯示與Arthrobacter aurescens.TC1的阿特拉津脫氯水解酶TrzN基因序同源性達(dá)99%。2.通過克隆撲草凈脫甲硫基降解基因,構(gòu)建具有T7強(qiáng)啟動子的pET-28 b+高效表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化至E.coil B21(DE3),構(gòu)建了撲草凈脫甲硫基酶的原核表達(dá)系統(tǒng)。重組蛋白His GraviTrap Co柱分離純化后,降解功能驗(yàn)證和SDS-PAGE分析表明重組蛋白表達(dá)成功。純化后蛋白酶的比活力由1.15±0.012 U/mg(粗酶液)提高到16.64±1.32 U/mg(純化酶),純化倍數(shù)為14.47倍,純化后的酶活性回收率為粗酶的2.7%。3.以撲草凈為反應(yīng)底物,研究了撲草凈脫甲硫基重組酶的酶學(xué)性質(zhì),酶最適反應(yīng)溫度為25℃,在4-25℃下穩(wěn)定性;最適反應(yīng)pH為8.0,pH在7-8之間穩(wěn)定,當(dāng)pH大于8或低于7時(shí),酶活性急劇下降。4.重組酶在25℃、pH為8.0的條件下催化反應(yīng)的米氏常數(shù)K_m為34μmol/L,最大反應(yīng)速率V_(max)為0.22μmol/(L min),該酶可以降解西草凈、敵草凈、甲氧丙凈、特丁凈、阿特拉津和撲滅通。
【圖文】：

三嗪類除草劑降解途徑Figure1-1Degradationpathwayoftriazineherbicidesbymicroorganisms

月1日已禁止三嗪類除用，我國撲草凈的銷售據(jù) 2016 年 WBISS C為 700 噸，出口額 2,06，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，，不易以上[55]。撲草凈在田間種植過程中撲草凈施藥達(dá)到 2.1kg/ha，棉花植，容易造成土壤和水體水產(chǎn)養(yǎng)殖中的凡納濱對0.028 mg/L[58, 59]。研究表異常），神經(jīng)系統(tǒng)異常（男性生殖系統(tǒng)的代謝異病增加、惡性腫瘤患者
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：X592;X72;Q78

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本文編號：2594526