【摘要】：黃海歷年大規(guī)模綠潮系由滸苔(Ulva prolifera)單一生態(tài)型構(gòu)成,提示其生物學(xué)特性是綠潮暴發(fā)的重要成因之一。藻類共附生細(xì)菌密切參與宿主的營養(yǎng)吸收、形態(tài)建成等關(guān)鍵過程,這為黃海綠潮的遺傳溯源與暴發(fā)機(jī)制研究提供了新角度。與附生菌相比,內(nèi)生菌與宿主的特異性往往更加穩(wěn)定,有必要開展差異性分析,但相關(guān)研究的方法學(xué)基礎(chǔ)尚未建立。本文首先使用16S rDNA通用引物,對漂浮與定生滸苔共附生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較分析,發(fā)現(xiàn)以下規(guī)律與問題:1)在細(xì)菌門和科的水平,漂浮與定生群體間存在明顯差別;2)發(fā)現(xiàn)CFB、浮霉菌等功能類群,但CFB缺乏功能驗(yàn)證方法,浮霉菌占比與文獻(xiàn)有顯著差異,提示須對內(nèi)生菌與附生菌區(qū)別研究;3)滸苔葉綠體DNA對擴(kuò)增具嚴(yán)重影響,須開展引物優(yōu)化或設(shè)計(jì)。針對上述方法學(xué)瓶頸,我們通過比較化學(xué)、物理、酶解等十幾種消毒方法,發(fā)明了用特定粒徑石英砂與滸苔共震蕩以徹底清除附生菌的高效方法并優(yōu)化了參數(shù),DGGE結(jié)果表明,新方法對內(nèi)生菌幾無影響,可以用于內(nèi)、附生菌群落結(jié)構(gòu)的差異性分析。為了消除藻類葉綠體編碼16S rDNA同源序列對內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)分析的嚴(yán)重影響,共建立兩種引物優(yōu)化方案:一是從引物設(shè)計(jì)、熱啟動、退火溫度三個方面優(yōu)化現(xiàn)有799F引物,可顯著降低葉綠體來源擴(kuò)增產(chǎn)物的比例,揭示了優(yōu)化原理;二是通過比較滸苔葉綠體與31個細(xì)菌門類的16S同源序列,發(fā)現(xiàn)了位于高度保守區(qū)的唯一雙堿基差異位點(diǎn),設(shè)計(jì)了新引物1525R,經(jīng)測序檢驗(yàn),可完全排除葉綠體影響。綠潮滸苔高度分枝、利于漂浮,是區(qū)別于定生群體的顯著形態(tài)差異,CFB細(xì)菌是參與滸苔形態(tài)建成(MG)的重要功能類群。本文用CFB細(xì)菌特異引物對8個漂浮與定生滸苔群體進(jìn)行了分析比較,分離鑒定獲得了可培養(yǎng)的CFB菌株,利用抗生素法建立了滸苔無菌發(fā)育實(shí)驗(yàn)體系,將用于菌株的MG功能驗(yàn)證。本文建立了附生菌選擇性去除、16S引物優(yōu)化與設(shè)計(jì)、無菌發(fā)育實(shí)驗(yàn)體系構(gòu)建等關(guān)鍵方法,為后續(xù)開展?jié)G苔共、附生菌群落結(jié)構(gòu)差異性分析及功能類群的檢驗(yàn)奠定了必要的方法學(xué)基礎(chǔ)。
[Abstract]:The large green tide of Huang Hai over the years is composed of a single ecotype of Enteromorpha enteromorpha, indicating that its biological characteristics are one of the important causes of green tide outbreak. Algae co-epiphytic bacteria are closely involved in the host nutrient absorption, morphogenesis and other key processes, which provides a new perspective for the genetic traceability and outbreak mechanism of Huang Hai green tide. The specificity of endophytic bacteria and host is more stable than that of epiphytic bacteria, so it is necessary to carry out diversity analysis, but the methodological basis of related studies has not been established. In this paper, using 16s rDNA universal primers, the community structure of coepiphytic bacteria of floating and stationary Enteromorpha enteromorpha was compared and analyzed. It was found that the following laws and question: 1) were found to be at the level of phylum and family. There were significant differences between floating and metaplastic populations (2) the functional groups such as CFB and floating fungi were found, but CFB was lack of functional verification method, and the proportion of floating fungi was significantly different from that in literature. It is suggested that the difference between endophytic and epiphytic bacteria should be studied. 3) chloroplast DNA of Enteromorpha enteromorpha has a serious effect on amplification and primer optimization or design should be carried out. In view of the above methodological bottlenecks, we have developed a highly efficient method of eliminating epiphytic bacteria thoroughly by shaking together with quartz sand and enteromorpha with specific particle size by comparing a dozen disinfection methods such as chemistry, physics and enzymatic hydrolysis, and optimizing the parameters of DGGE. The new method has little effect on endophytic bacteria and can be used to analyze the difference of endophytic bacteria community structure. In order to eliminate the serious influence of the 16s rDNA homologous sequence encoded by algae chloroplast on the analysis of endophytic community structure, two primer optimization schemes were established: one was to optimize the existing 799F primers from three aspects: primer design, hot start and annealing temperature. By comparing the 16s homologous sequences of chloroplasts with 31 bacteria species, we found the only double base difference site located in highly conserved region of Enteromorpha enteromorpha by reducing the proportion of chloroplast products derived from chloroplast and revealing the principle of optimization, and comparing the 16s homologous sequences of chloroplasts with 31 bacterial families. A new primer 1525 Rwas designed and sequenced. Green tide Enteromorpha enteromorpha is highly branched and easy to float, which is a significant morphological difference from Dingsheng population. CFB bacteria are important functional groups involved in the morphogenetic (MG) of Enteromorpha enteromorpha. In this paper, CFB bacteria specific primers were used to analyze and compare 8 floating and stationary populations of Enteromorpha enteromorpha. The culturable CFB strains were isolated and identified. The aseptic development test system of Enteromorpha margin was established by using antibiotic method, which will be used to verify the MG function of the strains. In this paper, the key methods, such as the optimization and design of 16s primer for selective removal of epiphytic bacteria and the construction of aseptic development experiment system, were established for the subsequent development of Enteromorpha enteromorpha. The difference analysis of epiphytic community structure and the examination of functional groups lay the necessary methodological foundation.
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院研究生院(海洋研究所)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：X55

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 ;戰(zhàn)滸苔 保奧運(yùn)——青島市處置罕見滸苔自然災(zāi)害綜述[J];中國應(yīng)急管理;2008年11期

2 張一諾;;解密“不速之客”滸苔[J];今日國土;2008年08期

3 李震;;青島近海滸苔的污染與預(yù)防治理[J];海洋開發(fā)與管理;2010年09期

4 海穹;;別讓滸苔成為青島的疤痕[J];環(huán)境保護(hù);2011年16期

5 楊同玉;;打贏這場“綠色”戰(zhàn)役——青島開發(fā)區(qū)滸苔處置工作紀(jì)實(shí)[J];海洋開發(fā)與管理;2011年08期

6 黃顯軍;駱其君;;光照與低溫對3種滸苔存活的影響[J];寧波大學(xué)學(xué)報(bào)(理工版);2012年01期

7 薛志欣;葉乃好;姜雪琴;夏延致;王霞;付永強(qiáng);許福超;;滸苔多糖紡絲性能的探索性研究[J];海洋科學(xué);2012年01期

8 ;滸苔再襲山東青島 已啟動滸苔災(zāi)害四級應(yīng)急響應(yīng)[J];水產(chǎn)科技情報(bào);2012年04期

9 劉春蘭;;青島滸苔暴發(fā)因素的探討及對策[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年04期

10 高嵩;潘懷福;韓愛香;;關(guān)于滸苔災(zāi)害應(yīng)對處置的實(shí)踐探索[J];海洋信息;2013年01期

相關(guān)會議論文 前10條

1 裴魯青;;浙江滸苔及針對滸苔災(zāi)害所引發(fā)的問題思考[A];2008年中國水產(chǎn)學(xué)會學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2008年

2 孫云潭;;北京奧運(yùn)會帆船比賽前夕滸苔災(zāi)害暴發(fā)與青島市應(yīng)急行動[A];2009中國海洋論壇論文集[C];2009年

3 黃容;馬艷;李慶寶;于進(jìn)付;;2008～2011年滸苔影響青島的海面風(fēng)觀測資料特征分析[A];戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)與科技支撐——青島市第十屆學(xué)術(shù)年會論文集[C];2012年

4 李德萍;楊育強(qiáng);董海鷹;郭麗娜;劉學(xué)忠;馬艷;;2008年青島海域滸苔大爆發(fā)天氣特征及成因分析[A];第26屆中國氣象學(xué)會年會氣象災(zāi)害與社會和諧分會場論文集[C];2009年

5 李三妹;劉誠;劉征;賃青;閆華;趙長海;;“3S”技術(shù)支持下的黃海滸苔綜合監(jiān)測[A];中國氣象學(xué)會2008年年會衛(wèi)星遙感應(yīng)用技術(shù)與處理方法分會場論文集[C];2008年

6 宋寧而;王琪;;日本的滸苔治理經(jīng)驗(yàn)及其對我國的啟示[A];2009中國海洋論壇論文集[C];2009年

7 張建恒;韓渭;霍元子;于克鋒;陳麗萍;曹佳春;何培民;;如東岸基滸苔類綠藻調(diào)查及海區(qū)綠潮早期形成過程[A];中國藻類學(xué)會第八次會員代表大會暨第十六次學(xué)術(shù)討論會論文摘要集[C];2011年

8 于克鋒;馮子慧;王陽陽;霍元子;何培民;;滸苔光合作用特性及光合固碳能力研究[A];中國藻類學(xué)會第八次會員代表大會暨第十六次學(xué)術(shù)討論會論文摘要集[C];2011年

9 鄭琳;崔文林;卜志國;袁媛;;青島近岸海域滸苔災(zāi)害防治初步研究[A];中國環(huán)境科學(xué)學(xué)會2009年學(xué)術(shù)年會論文集（第一卷）[C];2009年

10 吳婷;張?jiān)蒲?宋健偉;石曉勇;;營養(yǎng)鹽對滸苔生長影響的初步研究[A];中國海洋湖沼學(xué)會第十次全國會員代表大會暨學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2012年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 王賡;清運(yùn)滸苔 山東交通再顯鐵軍風(fēng)采[N];中國交通報(bào);2008年

2 胡亞;打造滸苔保衛(wèi)戰(zhàn)“奇兵”[N];中國氣象報(bào);2008年

3 陳飛;滸苔：困擾奧運(yùn)的綠色[N];健康報(bào);2008年

4 王建高;青島海域滸苔到底為何物？[N];科技日報(bào);2008年

5 王建高;青島海域滸苔到底如何治理？[N];科技日報(bào);2008年

6 張玉邋楊曉星 張羽;軍民聯(lián)手“戰(zhàn)”滸苔[N];青島日報(bào);2008年

7 本報(bào)記者 車亭邋趙雪筠 張克果 劉倩倩 朱筱杰;滸苔：殃及乳山 威脅文登[N];威海日報(bào);2008年

8 趙雪筠邋朱筱杰;滸苔分布：乳山減輕 文登加重[N];威海日報(bào);2008年

9 本報(bào)記者;全力支援青島清理滸苔[N];威海日報(bào);2008年

10 記者 趙雪筠邋朱筱杰;滸苔處置以晾曬掩埋為主[N];威海日報(bào);2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 劉青;黃海綠潮滸苔與浮游植物間的相互作用研究[D];中國科學(xué)院研究生院(海洋研究所);2015年

2 郇麗;滸苔響應(yīng)高鹽等環(huán)境脅迫因子的生理生化機(jī)制[D];中國科學(xué)院研究生院(海洋研究所);2015年

3 李儉平;滸苔對氮營養(yǎng)鹽的響應(yīng)及其氮營養(yǎng)鹽吸收動力學(xué)和生理生態(tài)研究[D];中國科學(xué)院研究生院（海洋研究所）;2011年

4 王影;兩種綠潮藻的生理生態(tài)學(xué)特征及其對黃海綠潮暴發(fā)期典型環(huán)境變化的響應(yīng)差異研究[D];中國海洋大學(xué);2012年

5 丁月e，

本文編號：2160047