本文關(guān)鍵詞：基于蛋白組學(xué)和同位素分餾對(duì)小球藻吸收氨氮機(jī)制的研究　出處：《湘潭大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：作為水環(huán)境中最常見(jiàn)的污染物,氨氮易引起富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)象等一系列環(huán)境問(wèn)題的發(fā)生,我國(guó)“十二五”期間已經(jīng)明確提出氨氮減排10%的目標(biāo)。藻類具有生長(zhǎng)迅速以及高效去除氨氮的能力,并且在消減氨氮的同時(shí),可作為魚(yú)類等水生生物的餌料以及再生能源的制備。因此,開(kāi)發(fā)基于藻類的生物技術(shù)消減氨氮,是污水廠實(shí)現(xiàn)氨氮達(dá)標(biāo)排放、減輕氨氮對(duì)水體自然生態(tài)環(huán)境危害程度的現(xiàn)實(shí)需要,也為氨氮轉(zhuǎn)化為有價(jià)值的生物資源提供理論和技術(shù)支持。利用氨氮作為唯一氮源的微生物能夠區(qū)分15N和14N,這種選擇性分餾為胞外不同氨氮水平在生物體內(nèi)吸收轉(zhuǎn)化提供重要證據(jù),而蛋白組學(xué)技術(shù)可揭示此吸收過(guò)程中參與氨氮代謝相關(guān)蛋白的差異。研究表明,藻類對(duì)氨氮的去除主要是通過(guò)氨氮的吸收,然而與氨氮吸收代謝相關(guān)的氮同位素效應(yīng),特別是不同氨氮濃度水平對(duì)藻類吸收氨氮的影響機(jī)制,包括藻體中氨氮的分餾效應(yīng)和參與氨氮代謝的相關(guān)基因和酶,到目前還沒(méi)有充分揭示。為此,本文以小球藻(Chlorella vulgaris)為代表,以氨氮為唯一氮源,利用15N分餾機(jī)制和蛋白組學(xué)研究了不同氨氮濃度水平對(duì)藻類吸收氨氮的差異,以及在此過(guò)程中參與氨氮代謝的相關(guān)基因和酶類,并探索了藻類對(duì)氨氮的吸收機(jī)制。論文獲得了以下研究結(jié)論:(1)在4-50 mg/L初始氨氮濃度條件下,小球藻生長(zhǎng)速率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),且在10 mg/L時(shí)達(dá)到最大(4.86×105cells/(mL?d))。小球藻對(duì)氨氮的去除效率隨初始氨氮濃度的升高而降低,實(shí)驗(yàn)六天后氨氮的去除率由100%降至0.4%。小球藻對(duì)氨氮的吸收速率隨著初始氨氮濃度的升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì),且在10 mg/L時(shí)達(dá)到最大(2.05×10-10mg/(cell?d))。因此,在10 mg/L氨氮濃度條件下,小球藻具有最大的生長(zhǎng)速率以及氨氮吸收速率。葉綠素含量隨著氨氮濃度的升高也呈現(xiàn)相同的趨勢(shì),且在10 mg/L時(shí)葉綠素a(6.49 mg/L)和葉綠素b(6.31 mg/L)均達(dá)到最大。通過(guò)不同氨氮濃度和碳源濃度共同作用對(duì)小球藻生長(zhǎng)、氨氮吸收量和碳源吸收量的影響表明,隨著碳源濃度的升高,小球藻生物量整體呈上升趨勢(shì),且在40 mg/L時(shí)達(dá)最大(12.21×105 cells/(mL?d))。且相同氨氮濃度下,碳源濃度高于20 mg/L時(shí)氨氮去除率均可達(dá)100%,對(duì)碳源的吸收量整體呈上升趨勢(shì),在40 mg/L達(dá)到最大(3.94 mg)。(2)藻細(xì)胞內(nèi)氮同位素分餾程度取決于環(huán)境中氨氮的濃度。在10 mg/L氨氮濃度條件下,培養(yǎng)液和藻細(xì)胞的15N的豐度分別為-3.61±0.06‰和-1.99±0.05‰,富集系數(shù)為-1.63±0.06‰。而在4 mg/L氨氮濃度條件下,其培養(yǎng)液和藻細(xì)胞的15N的豐度分別為-3.50±0.08‰和-1.13±0.06‰,富集系數(shù)為-2.37±0.08‰。說(shuō)明10mg/L氨氮條件下,小球藻對(duì)氨氮具有更明顯的分餾效應(yīng)。此外通過(guò)生物轉(zhuǎn)化率的比較發(fā)現(xiàn),在10 mg/L氨氮濃度條件下小球藻對(duì)氨氮的轉(zhuǎn)化率(47.4%)明顯高于4 mg/L(7.0%),也即外部的氨氮轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)含氮化合物或生物量的程度更顯著。(3)蛋白組學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),小球藻在10 mg/L氨氮條件相對(duì)4 mg/L氨氮有162個(gè)蛋白斑點(diǎn)表現(xiàn)出不同程度的上調(diào)和下調(diào),其中有92個(gè)斑點(diǎn)具有顯著性的差異表達(dá)(n≥3,p0.05)。通過(guò)飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定出有31個(gè)蛋白分別參與了光合作用、糖代謝、三羧酸(TCA)循環(huán)、氨基酸代謝和蛋白質(zhì)合成等等。其中氨基酸代謝是與氮代謝直接相關(guān)的代謝過(guò)程,尤其是谷氨酸代謝是其余氨基酸代謝以及TCA循環(huán)等的中間代謝過(guò)程。谷氨酰胺合成酶(GS)作為氨氮在細(xì)胞內(nèi)的初級(jí)轉(zhuǎn)化酶,可迅速將氨氮轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺和谷氨酸。二維凝膠雙向電泳發(fā)現(xiàn)GS蛋白在10 mg/L氨氮條件上調(diào)了6.44倍,并且通過(guò)實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)驗(yàn)證其GS基因表達(dá)倍數(shù)上調(diào)了18.03倍。說(shuō)明此酶在促進(jìn)藻細(xì)胞生長(zhǎng)以及對(duì)氨氮的吸收利用發(fā)揮了極其重要的作用。
[Abstract]:As one of the most common pollutants in water environment, ammonia is easy to cause a series of environmental problems such as eutrophication phenomenon occurred in China during the "12th Five-Year" has clearly put forward the ammonia emission reduction target of 10%. With the rapid growth of algae and high ammonia nitrogen removal ability, and in the reduction of ammonia nitrogen at the same time, can be used as fish and other aquatic organisms the feed and the preparation of renewable energy. Therefore, the development of algae biotechnology is based on ammonia abatement, ammonia emission standards of sewage treatment plant, reduce the need for ammonia water natural ecological environment harm degree of reality, but also provide theoretical and technical support for ammonia nitrogen into valuable biological resources. By using ammonia as the sole nitrogen source microorganisms are able to distinguish between 15N and 14N, the selective fractionation for different extracellular level of ammonia in vivo transformation provides important evidence and technology group can expose protein The difference of ammonia nitrogen metabolism related proteins involved in the absorption process is shown in this. The study showed that the algae removal of ammonia is mainly by ammonia absorption, but absorption of nitrogen isotope effect and ammonia metabolism, especially the different concentration of ammonia absorption level influence mechanism of nitrogen by algae, including ammonia nitrogen fractionation in algae and related genes in ammonia metabolism and enzyme, has not been fully revealed. Therefore, this paper (Chlorella vulgaris) as the representative of Chlorella, using ammonia nitrogen as the sole nitrogen source, the difference by 15N fractionation mechanism and proteomics study on the different level of ammonia nitrogen concentration of ammonia nitrogen absorbed on algae, ammonia metabolism and related genes in this process and enzymes, and to explore the absorption mechanism of algae on ammonia nitrogen. The research obtained the following conclusions: (1) in the 4-50 mg/L initial concentration condition, the growth rate of Chlorella First increased and then decreased, and reached the maximum at 10 mg/L (4.86 * 105cells/ (mL? D)). The removal efficiency of ammonia nitrogen on Chlorella decreased with increasing initial concentration of ammonia nitrogen, six days after the experiment the removal rate of ammonia nitrogen decreased from 100% to 0.4%. on the absorption rate of Chlorella with the initial concentration of ammonia nitrogen appeareddecreasing first increased and then decreased, and reached the maximum at 10 mg/L (2.05 * 10-10mg/ (cell? D)). Therefore, in 10 mg/L ammonia nitrogen concentration, the growth rate of Chlorella has the largest absorption rate of ammonia nitrogen and chlorophyll content. With the increase of ammonia concentration also showed the same trend, and in the 10 mg/L chlorophyll a (6.49 mg/L) and chlorophyll b (6.31 mg/L) reached the maximum. On Chlorella Growth through interaction between different ammonia concentration and concentration of carbon source, nitrogen uptake and carbon absorption effects show that with carbon source concentration Increase the overall Chlorella biomass increased, and reached the maximum at 40 mg/L (12.21 x 105 cells/ (mL? D)). And the same concentration of ammonia, carbon source concentration is higher than 20 mg/L ammonia nitrogen removal rate could reach 100%. The overall uptake of carbon source showed an upward trend, reaching a maximum at 40 mg/L (3.94 mg). (2) the concentration of intracellular nitrogen isotope fractionation degree depends on the environment. In 10 mg/L ammonia nitrogen concentration, the abundance of culture medium and cell 15N were -3.61 + 0.06 and -1.99 + 0.05%%, enrichment coefficient of -1.63 + 0.06 per thousand in 4. Mg/L ammonia concentration under the condition of the medium and cell abundance of 15N were -3.50 + 0.08 and -1.13 + 0.06 per thousand per thousand, enrichment coefficient is -2.37 + 0.08. 10mg/L% ammonia nitrogen conditions, Chlorella fractionation effect is more obvious. In addition the conversion rate of ammonia nitrogen by biological comparison found in 10 mg/L ammonia nitrogen Concentration of ammonia conversion rate of Chlorella (47.4%) was significantly higher than that of 4 mg/L (7%), namely the external ammonia nitrogen into nitrogen or cell biomass containing more significant degree. (3) proteomics research results showed that Chlorella 162 protein spots showed different degrees of up and down in 10 mg/L 4 mg/L ammonia ammonia condition is relatively, which has 92 differentially expressed spots with significant (n = 3, P0.05). By the time of flight mass spectrometry identified 31 proteins were involved in photosynthesis, sugar metabolism, three carboxylic acid (TCA) cycle, amino acid metabolism and protein synthesis. The metabolism of amino acid metabolism the process is directly related to nitrogen metabolism, especially glutamate metabolism is intermediate metabolic processes in other amino acid metabolism and TCA cycle. Glutamine synthetase (GS) as the primary enzyme of ammonia nitrogen in cells, can be quickly Ammonia is converted to glutamine and glutamate. Two dimensional gel electrophoresis showed that GS protein in 10 mg/L ammonia nitrogen conditions raised 6.44 times, and by real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR) to verify the GS gene expression ratio raised 18.03 times. This enzyme plays an extremely important role in promoting the growth of algae and the absorption of ammonia use.

【學(xué)位授予單位】：湘潭大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：X52;X173

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本文編號(hào)：1376067