發(fā)布時間：2017-10-24 06:34

  本文關(guān)鍵詞：羧基裂解酶基因在施氏假單胞菌N2代謝苯酚過程中的作用研究

  更多相關(guān)文章： 施氏假單胞菌N2 羧基裂解酶基因ubiX和ubiD 苯酚 鄰苯二酚雙加氧酶 開環(huán)裂解途徑

【摘要】：苯酚是普遍存在于環(huán)境中常見的污染物,目前已分離出諸多能以苯酚為唯一碳源和能源的菌株。對細菌中苯酚羥化酶、鄰苯二酚鄰/間位開環(huán)裂解酶研究較為充分。而苯酚羧化是啟動苯酚代謝的主要途徑之一,目前僅有厭氧條件下羧化的報道。本課題組前期分離獲得一株快速降解苯酚的菌株—施氏假單胞菌N2,在好氧代謝時常產(chǎn)羧化中間產(chǎn)物。本文旨在調(diào)取其羧基裂解酶基因,構(gòu)建基因工程菌,研究并揭示相關(guān)基因在降解苯酚過程中的作用。本論文以野生施氏假單胞菌N2為研究對象,利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建羧基裂解酶基因突變株,以液相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀及其紫外光譜等分析技術(shù),研究野生菌株及其突變株代謝苯酚的差異性,揭示了ubiX和ubiD基因在施氏假單胞菌N2降解苯酚過程中的作用,獲得以下成果:(1)發(fā)現(xiàn)施氏假單胞菌N2中ubiD和ubiX兩個基因目前功能并不明確。利用分子生物學(xué)技術(shù)成功構(gòu)建施氏假單胞菌N2兩株羧基裂解酶基因單突變株N2ubiD-、N2ubiX-和雙突變株N2ubi X-ubiD-等基因工程菌。(2)研究發(fā)現(xiàn)缺失ubiD和ubiX基因降低菌株抵抗苯酚毒性和降解苯酚的能力,尤其是缺失ubiX基因使菌株前期代謝苯酚的能力明顯下降。缺失基因ubiD則不易以間位開環(huán)裂解方式降解苯酚,而缺失基因ubiX則不易以鄰位開環(huán)裂解。盡管野生菌和突變菌以苯酚為唯一碳源生長時,均能通過羥化和羧化啟動苯酚的代謝,并產(chǎn)“順,順-己二烯二酸”和“2-羥基粘糠酸半醛(2-HMS)”開環(huán)裂解中間物,但僅野生菌株與單突變株N2ubiX-代謝苯酚時,易檢測到羧化+還原反應(yīng)轉(zhuǎn)化的開環(huán)裂解產(chǎn)物,說明ubiD易在細胞中產(chǎn)生還原能力。(3)共存乙醇和丙酮等碳源能提高雙突變菌株N2ubiX-ubiD-抗苯酚毒性及代謝苯酚的能力,使其在后期,生長速度加快。而共存乙醇能加快N2菌野生株及其突變株對苯酚的降解與轉(zhuǎn)化。共存乙醇均能同時誘導(dǎo)各菌株中“鄰苯二酚1,2-雙加氧酶”和“鄰苯二酚2,3-雙加氧酶”。而缺失ubiX基因的突變株,因乙醇共存可明顯減少降解液中順,順-己二烯二酸和2-HMS的積累量,說明這兩個中間產(chǎn)物被該菌株進一步降解轉(zhuǎn)化速度較快。
【關(guān)鍵詞】：施氏假單胞菌N2 羧基裂解酶基因ubiX和ubiD 苯酚 鄰苯二酚雙加氧酶 開環(huán)裂解途徑
【學(xué)位授予單位】：西安建筑科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：X172
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 1 緒論10-20
• 1.1 苯酚的結(jié)構(gòu)特點、性能、污染現(xiàn)狀及危害10-12
• 1.1.1 苯酚的結(jié)構(gòu)特點及其性能10
• 1.1.2 環(huán)境中苯酚來源及污染現(xiàn)狀10-12
• 1.1.3 苯酚的危害12
• 1.2 苯酚物理化學(xué)處理技術(shù)研究現(xiàn)狀12-14
• 1.2.1 物理法及其優(yōu)缺點12-13
• 1.2.2 化學(xué)法及其優(yōu)缺點13-14
• 1.3 苯酚的微生物降解研究現(xiàn)狀14-17
• 1.3.1 苯酚降解菌的研究現(xiàn)狀14-15
• 1.3.2 共存碳源對微生物降解苯酚的影響作用15
• 1.3.3 苯酚降解機理及研究現(xiàn)狀15-17
• 1.3.4 微生物修復(fù)苯酚污染環(huán)境的優(yōu)勢17
• 1.4 施氏假單胞菌降解苯酚的研究現(xiàn)狀17-18
• 1.4.1 施氏假單胞菌的生理特性17-18
• 1.4.2 施氏假單胞菌的代謝特性18
• 1.4.3 施氏假單胞菌N2對苯酚的降解性能18
• 1.5 本論文研究意義及內(nèi)容18-20
• 1.5.1 本論文研究意義18-19
• 1.5.2 本論文研究的內(nèi)容19-20
• 2 施氏假單胞菌N2羧基裂解酶基因突變菌株構(gòu)建20-31
• 2.1 施氏假單胞菌N2菌羧基裂解酶基因突變菌株構(gòu)建技術(shù)路線20-21
• 2.2 實驗材料21-22
• 2.2.1 實驗材料21-22
• 2.2.2 實驗試劑及儀器22
• 2.3 實驗方法22-27
• 2.3.1 PCR擴增施氏假單胞菌N2羧基裂解酶基因ubi X、ubi D22-24
• 2.3.2 施氏假單胞菌N2羧基裂解酶基因ubi D突變株的構(gòu)建24-25
• 2.3.3 施氏假單胞菌N2羧基裂解酶基因ubi X突變株的構(gòu)建25-26
• 2.3.4 施氏假單胞菌N2羧基裂解酶基因ubi X、ubi D雙突變株的構(gòu)建26-27
• 2.3.5 施氏假單胞菌N2羧基裂解酶基因突變菌株的培養(yǎng)驗證27
• 2.4 實驗結(jié)果27-30
• 2.4.1 施氏假單胞菌N2羧基裂解酶基因ubi X和ubi D片段的電泳結(jié)果27
• 2.4.2 施氏假單胞菌N2羧基裂解酶基因ubiX和ubiD自殺性質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果27-28
• 2.4.3 施氏假單胞菌N2羧基裂解酶基因單、雙突變菌株的驗證28-30
• 2.5 小結(jié)30-31
• 3 施氏假單胞菌N2羧基裂解酶基因在苯酚降解中的作用研究31-50
• 3.1 材料與方法31-35
• 3.1.1 實驗材料31-33
• 3.1.2 實驗方法33-34
• 3.1.3 分析方法34-35
• 3.2 結(jié)果與討論35-49
• 3.2.1 施氏假單胞菌N2及其突變株對苯酚毒性的響應(yīng)特性35-36
• 3.2.2 苯酚對N2菌及其突變株鄰苯二酚開環(huán)裂解酶的誘導(dǎo)作用36-39
• 3.2.3 施氏假單胞菌N2及其突變株降解苯酚中間產(chǎn)物分離與鑒定結(jié)果39-49
• 3.3 小結(jié)49-50
• 4 共存碳源對施氏假單胞菌N2及其羧基裂解酶基因突變株降解苯酚的影響50-59
• 4.1 材料與方法50-51
• 4.1.1 實驗材料50
• 4.1.2 實驗方法50
• 4.1.3 分析方法50-51
• 4.2 結(jié)果與討論51-58
• 4.2.1 共存碳源對施氏假單胞菌N2及其突變株抗苯酚毒性的影響51-52
• 4.2.2 共存碳源對苯酚誘導(dǎo)各菌株鄰苯二酚開環(huán)裂解酶的影響作用52-54
• 4.2.3 乙醇共存時施氏假單胞菌N2菌及其突變株代謝苯酚中間產(chǎn)物鑒定結(jié)果54-58
• 4.3 小結(jié)58-59
• 5 結(jié)論與展望59-61
• 5.1 結(jié)論59-60
• 5.2 建議60-61
• 參考文獻61-66
• 致謝66-67
• 附錄 碩士研究生學(xué)習(xí)階段發(fā)表論文67

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本文編號：1087515