本文關(guān)鍵詞：萊茵衣藻高產(chǎn)油脂藻株的誘變篩選及其油脂代謝關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：面對(duì)日益枯竭的化石能源和嚴(yán)重惡化的生態(tài)環(huán)境，生物柴油作為一種新型可再生的清潔能源，引起世界各國(guó)的關(guān)注。微藻能進(jìn)行光合作用，生長(zhǎng)速度快、油脂含量高、且培養(yǎng)占用耕地，被認(rèn)為是最具潛力的油脂生物能源。但是生產(chǎn)成本較高，微藻能源至今未突破產(chǎn)業(yè)化這個(gè)瓶頸。本研究旨在通過(guò)誘變選育的方法獲得生長(zhǎng)速度快且油脂含量高的微藻，，并對(duì)其油脂代謝關(guān)鍵酶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析，探究其油脂含量增加的可能原因和途徑，以期為微藻生物柴油高產(chǎn)油脂藻種的選育及在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用基因工程手段進(jìn)行藻株的改造提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。 本實(shí)驗(yàn)首先確定了紫外線照射時(shí)間（20s，25s）與喹禾靈篩選濃度（5.5，6.0μmol/L），采用紫外線誘變與喹禾靈脅迫相結(jié)合的方法對(duì)萊茵衣藻CC-124進(jìn)行定向選育。通過(guò)測(cè)定生長(zhǎng)速率初篩出5株生長(zhǎng)速度較快的突變?cè)逯辏媚崃_紅染色對(duì)限氮培養(yǎng)第4天的藻細(xì)胞油脂進(jìn)行觀察，挑選出了2株油脂顆粒大且數(shù)目多的突變?cè)逯辏?-2-2和9-2-7。采用酸解法測(cè)定了出發(fā)株和突變株限氮培養(yǎng)第0、4、6天時(shí)中性脂的含量，2個(gè)突變?cè)逯甓急憩F(xiàn)出高于出發(fā)藻株的中性脂水平。 利用GeNorm、BestKeeper和NormFinder三個(gè)內(nèi)參基因篩選軟件從18S rRNA、COX4、COX12、actin這四個(gè)候選內(nèi)參基因中選出表達(dá)最穩(wěn)定的COX12作為最適內(nèi)參基因，對(duì)出發(fā)藻株、突變?cè)逯?-2-2和9-2-7在限氮培養(yǎng)0、2、4、6天時(shí)4個(gè)微藻油脂代謝關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。這4個(gè)酶分別為乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）、長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A合成酶（LACS）和二酰甘油�；D(zhuǎn)移酶（DGAT）（包括DGAT1和DGAT2兩個(gè)異構(gòu)酶）。根據(jù)這些酶基因的轉(zhuǎn)錄水平分析及其相應(yīng)的油脂含量，可以看出這兩個(gè)突變?cè)逯甑挠椭e累模式基本相同，都具有生長(zhǎng)和油脂積累兩方面的優(yōu)勢(shì)。盡管從中性脂含量看來(lái)，突變?cè)逯?-2-7略高于突變?cè)逯?-2-2，但后者在ACC基因和DGAT2基因表達(dá)上具有明顯優(yōu)勢(shì)，有可能具有更持久的合成脂肪的能力。
【關(guān)鍵詞】：萊茵衣藻 紫外線 喹禾靈 油脂合成 基因表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：TE667
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 第一章 前言11-31
• 1 生物柴油概述11-13
• 2 微藻生產(chǎn)生物柴油13-25
• 2.1 影響微藻生長(zhǎng)和油脂產(chǎn)生的因素13-15
• 2.3 微藻生物柴油的發(fā)展歷程15-16
• 2.4 微藻生物柴油的優(yōu)勢(shì)16-17
• 2.5 微藻細(xì)胞中油脂合成途徑17-20
• 2.6 幾個(gè)在油脂合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶20-25
• 2.6.1 乙酰輔酶 A 羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase，ACCase）20-23
• 2.6.2 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶23-25
• 3 微藻的遺傳改良及其在生物能源上的應(yīng)用25-28
• 3.1 誘變育種25-27
• 3.1.1 物理誘變育種25-27
• 3.1.2 化學(xué)誘變育種27
• 3.2 原生質(zhì)體融合27
• 3.3 基因工程育種27-28
• 4 衣藻在能源微藻研究中的應(yīng)用28-30
• 5 研究目的和內(nèi)容30-31
• 5.1 本論文的研究目的30
• 5.2 本論文的研究?jī)?nèi)容30-31
• 第二章 喹禾靈對(duì)紫外誘變衣藻高產(chǎn)油脂藻株的定向選育31-46
• 1 材料31-33
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料31-32
• 1.2 培養(yǎng)基32
• 1.3 試劑32
• 1.4 儀器32-33
• 2 方法33-37
• 2.1 藻種的培養(yǎng)33
• 2.2 細(xì)胞密度的測(cè)定33
• 2.3 紫外線誘變輻射劑量的確定33-34
• 2.4 有效喹禾靈濃度的選擇34
• 2.5 紫外線誘變與喹禾靈相結(jié)合對(duì)衣藻進(jìn)行高油脂含量藻株的篩選34
• 2.6 突變?cè)逯甑暮Y選34-35
• 2.7 藻株油脂的尼羅紅染色35
• 2.8 萊茵衣藻生長(zhǎng)速率的測(cè)定35-36
• 2.8.1 正常培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)曲線的測(cè)定35-36
• 2.8.2 限氮培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)曲線的測(cè)定36
• 2.9 突變?cè)逯暝谙薜囵B(yǎng)條件下中性脂含量的測(cè)定36-37
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析37-44
• 3.1 萊茵衣藻培養(yǎng)液 OD 值與細(xì)胞密度相關(guān)系數(shù)的確定37
• 3.2 有效紫外線照射劑量的確定37-38
• 3.3 有效喹禾靈篩選濃度的確定38-39
• 3.4 萊茵衣藻的誘變及定向選育結(jié)果39-40
• 3.5 根據(jù)生長(zhǎng)速率對(duì)待測(cè)藻株的初篩40-41
• 3.6 尼羅紅染色對(duì)突變?cè)逯赀M(jìn)行復(fù)篩獲得高油脂突變?cè)逯?/span>41
• 3.7 高油脂含量突變?cè)逯甑纳L(zhǎng)曲線比較41-42
• 3.8 限氮培養(yǎng)條件對(duì)衣藻生長(zhǎng)速率的影響42-43
• 3.9 突變?cè)逯暝谌钡囵B(yǎng)條件下的油脂含量43-44
• 4 討論44-46
• 第三章 萊茵衣藻突變株油脂代謝關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄分析46-76
• 1 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 內(nèi)參基因的篩選46-63
• 1.1 材料46-47
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料46-47
• 1.1.2 試劑與儀器47
• 1.2 方法47-52
• 1.2.1 萊茵衣藻總 RNA 的提取47-48
• 1.2.2 cDNA 第一鏈的合成48-49
• 1.2.3 引物設(shè)計(jì)及 PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化49-50
• 1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 內(nèi)參基因的篩選50-51
• 1.2.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理51-52
• 1.3 結(jié)果與分析52-60
• 1.3.1 萊茵衣藻總 RNA 提取52-53
• 1.3.2 引物檢測(cè)結(jié)果53
• 1.3.3 檢測(cè)合成的 cDNA53-54
• 1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR54-60
• 1.4 討論60-63
• 1.4.1 內(nèi)參基因的選擇及不穩(wěn)定因素60-62
• 1.4.2 萊茵衣藻突變株內(nèi)參基因的分析62-63
• 2 突變?cè)逯暧椭x相關(guān)基因的表達(dá)分析63-76
• 2.1 材料63
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料63
• 2.1.2 試劑與儀器63
• 2.2 方法63-64
• 2.2.1 引物設(shè)計(jì)及 PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化63-64
• 2.2.2 目的基因?qū)崟r(shí)熒光定量 PCR64
• 2.3 結(jié)果與分析64-72
• 2.3.1 引物的檢測(cè)結(jié)果64-65
• 2.3.2 目的基因 ACC 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR65-66
• 2.3.3 目的基因 PEPC2 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR66-67
• 2.3.4 目的基因 LACS 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR67-68
• 2.3.5 目的基因 DGAT1 基因?qū)崟r(shí)熒光定量 PCR68-69
• 2.3.6 目的基因 DGTT1 基因?qū)崟r(shí)熒光定量 PCR69-70
• 2.3.7 目的基因 DGTT2 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR70-71
• 2.3.8 目的基因 DGTT3 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR71-72
• 2.3.9 目的基因 DGTT4 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR72
• 2.4 討論72-76
• 第四章 總結(jié)與展望76-77
• 參考文獻(xiàn)77-86
• 致謝86-87
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷87-88

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本文編號(hào)：258699