本文關(guān)鍵詞：去甲腎上腺素功能化PDMS微芯片在生物樣品分離中的應(yīng)用研究

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【摘要】：微芯片電泳起源于上世紀(jì)90年代初期,它首次運(yùn)用微加工技術(shù),在玻璃、硅片、石英和一些高分子聚物等原材料上加工制作出了用于電泳分離的微通道。由于離子或分子與固定相之間的電遷移或分配行為上的不同,借助于電場(chǎng)力的作用,在平方厘米大小的芯片上,可以實(shí)現(xiàn)分析樣本從進(jìn)樣、反應(yīng)、分離和檢測(cè)等過(guò)程。由于該分析方法具有操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、試劑使用量較少、通量高、易于微型化等優(yōu)點(diǎn),它儼然已成為了生化分析中一個(gè)重要研究領(lǐng)域。但是在常用的一些芯片制備的原材料中,聚二甲基硅氧烷芯片(PDMS)自身存在一些不可避免的缺點(diǎn):如表面固有的疏水性,電滲流穩(wěn)定性差、易吸附被測(cè)組分,導(dǎo)致分離分析效率降低;導(dǎo)熱性差,制約了高分離電壓的運(yùn)用等缺點(diǎn)。這就限制了其在生物樣品分析檢測(cè)領(lǐng)域的使用。進(jìn)而尋找新的涂層材料以及制備新型固定相對(duì)PDMS表面修飾改性,對(duì)生物樣品的分離分析就成為我們亟待解決的問題。去甲腎上腺素(NE)是一種類多巴胺的兒茶酚胺類小分子,在弱堿性條件下即可自聚合生成聚去甲腎上腺素(PNE)而粘附在幾乎所有材料的表面。利用其在弱堿性條件下的自聚合作用及良好的成膜性,建立了一種對(duì)PDMS微流控芯片通道的簡(jiǎn)單、綠色的修飾方法。經(jīng)聚去甲腎上腺素(PNE)功能化的PDMS芯片通道,不僅親水性得到極大改善,還獲得了穩(wěn)定的電滲流,這就為在功能化的PDMS芯片上拆分不同類型生物分子開辟了一條林蔭大道。本文用PNE對(duì)PDMS微芯片內(nèi)通道進(jìn)行修飾改性,并應(yīng)用于生物分析樣本的分離分析,以此為基礎(chǔ)我們開展了以下幾個(gè)方面的工作:1.利用去甲腎上腺素在弱堿性條件下的自聚合作用及良好的成膜性,建立了一種對(duì)聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控芯片通道的簡(jiǎn)單、綠色的表面修飾方法。經(jīng)聚去甲腎上腺素(PNE)功能化的PDMS芯片通道,在PDMS芯片充滿去甲腎上腺素(NE)溶液后,在溶液中氧化逐漸形成聚去甲腎上腺素膜并沉積在微通道內(nèi)壁作為永久涂層,由于擁有豐富的兒茶酚和胺官能團(tuán),經(jīng)PNE涂層修飾的PDMS表面具有更好的潤(rùn)濕性,可以獲得更加穩(wěn)定的電滲流和更少的非特異性吸附。與未修飾的PDMS相比較,經(jīng)過(guò)測(cè)量其接觸角和電滲流分別為108°和2.24×10-4 cm2 V-1 s-1,而經(jīng)過(guò)PNE修飾的PDMS芯片,其接觸角和電滲流分別降低為13°和1.68×10-4 cm2 V-1 s-1。經(jīng)過(guò)耦合柱內(nèi)安培檢測(cè)技術(shù),在有效分離長(zhǎng)度為37 mm的PNE修飾后的PDMS芯片通道內(nèi),不同種類的手性化合物,例如手性氨基酸,手性藥物,手性多肽等,可以成功達(dá)到基線分離。這種巧妙的基于PNE修飾的芯片體系,展現(xiàn)了強(qiáng)效的手性識(shí)別能力,非常好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性,這些性能使得其在復(fù)雜生物樣品的分析中展現(xiàn)出了更大的潛力。2.提出了一種基于磁性分子印跡技術(shù),在PDMS芯片通道內(nèi)用于多種物質(zhì)同時(shí)檢測(cè)。首先,在弱堿性條件下,以Fe_3O_4 NPs為支撐載體,以NE做功能單體,在存在目標(biāo)分子L-色氨酸條件下,利用NE自聚合生成一層穩(wěn)定的、親水性的PNE涂層,其可將模板分子L-色氨酸鑲嵌于Fe_3O_4@PNE NPs的表面,通過(guò)使用洗脫劑十二烷基磺酸鈉-醋酸,將模板分子洗脫出來(lái),制備出與模板分子相匹配的三維空腔的分子印跡聚合物(MIP-Fe_3O_4@PNE NPs),然后將其磁性固定于芯片通道內(nèi),成功用于D/L-色氨酸手性對(duì)映體拆分。類似的我們制備了相對(duì)應(yīng)于單個(gè)的不同的模板分子的分子印跡聚合物MIP-Fe_3O_4@PNE NPs,如分別以L-纈氨酸,L-蘇氨酸,甘氨酸-L-苯丙氨酸,S-(-)-聯(lián)萘酚和S-(-)-氧氟沙星作為模板分子,并磁性固定于通道內(nèi)成功拆分了相對(duì)映的各種對(duì)映體。更重要的是,將單獨(dú)印跡了相對(duì)應(yīng)的模板分子的分子印跡聚合物混合,固定于通道內(nèi)做固定相,在同一通道內(nèi)的不同類型的幾對(duì)對(duì)映體也可同時(shí)達(dá)到基線分離。3.以Fe_3O_4磁性微球?yàn)檩d體,利用去甲腎上腺素在弱堿性溶液中的自聚合作用,在Fe_3O_4磁性微球表面形成聚去甲腎上腺素(PNE)。制備的Fe_3O_4@PNE磁性納米微球,一方面具有良好的磁性,使其在外磁場(chǎng)作用下即可簡(jiǎn)單地固定于PDMS通道內(nèi);另一方面,PNE中的兒茶酚羥基可以與Ti~(4+)螯合,而將Ti~(4+)固定在Fe_3O_4@PNE功能化PDMS通道內(nèi)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)激酶A(PKA)存在時(shí),PKA催化ATP將磷酸根轉(zhuǎn)移到底物多肽上,進(jìn)而與固定于通道內(nèi)的Ti~(4+)結(jié)合,而未磷酸化的多肽則不與Ti~(4+)發(fā)生作用,以此達(dá)到磷酸化多肽與未磷酸化多肽的分離,并據(jù)此實(shí)現(xiàn)PKA的快速和靈敏檢測(cè)。
【關(guān)鍵詞】：PDMS芯片 聚去甲腎上腺素 磁性分子印跡聚合物 手性物質(zhì)拆分 蛋白質(zhì)激酶A
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：TN492
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 第1章 引言11-24
• 1.1 芯片毛細(xì)管電泳簡(jiǎn)述11-12
• 1.2 芯片毛細(xì)管電泳的理論研究12-13
• 1.2.1 電滲流(EOF)12-13
• 1.2.2 分離度的計(jì)算13
• 1.3 微流控芯片技術(shù)13-22
• 1.3.1 芯片取材和加工技術(shù)14-17
• 1.3.1.1 芯片的取材14-15
• 1.3.1.2 芯片的加工技術(shù)15-17
• 1.3.2 微流體的控制和驅(qū)動(dòng)技術(shù)17
• 1.3.3 微芯片毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)17-19
• 1.3.3.1 光學(xué)檢測(cè)器18-19
• 1.3.3.2 電化學(xué)檢測(cè)器19
• 1.3.3.3 質(zhì)譜檢測(cè)器19
• 1.3.4 微流控芯片電泳在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用研究19-22
• 1.3.4.1 細(xì)胞分析19-20
• 1.3.4.2 生物分子分離20-21
• 1.3.4.2 蛋白質(zhì)分析21
• 1.3.4.3 免疫分析21-22
• 1.4 本課題的提出22-24
• 第2章 基于聚去甲腎上腺素涂層的PDMS用于手性化合物的分離24-37
• 2.1 引言24-27
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分27-29
• 2.2.1 化學(xué)試劑和表征27-28
• 2.2.2 PDMS芯片的構(gòu)造28
• 2.2.3 電滲流的測(cè)定28-29
• 2.2.4 PNE功能化PDMS芯片的制備29
• 2.2.5 手性分離和檢測(cè)過(guò)程29
• 2.3 結(jié)果與討論29-36
• 2.3.1 PNE功能化的PDMS芯片的表征29-31
• 2.3.2 PNE修飾PDMS芯片的電滲流31-32
• 2.3.3 手性拆分條件的優(yōu)化32-33
• 2.3.4 手性化合物的手性拆分33-34
• 2.3.5 定量檢測(cè)、再現(xiàn)性和穩(wěn)定性34-35
• 2.3.6 在復(fù)雜生物樣品中苯丙氨酸試驗(yàn)分析35-36
• 2.4 結(jié)論36-37
• 第3章 基于磁性分子印跡聚合物的手性物質(zhì)識(shí)別研究37-55
• 3.1 引言37-39
• 3.2 材料與方法39-43
• 3.2.1 PDMS微流控芯片的制備40-41
• 3.2.2 MIP-Fe_3O_4@PNE NPs的合成41
• 3.2.3 MIP-Fe_3O_4@PNE NPs填充微芯片的制備41-42
• 3.2.4 用于手性分離的設(shè)備42-43
• 3.2.5 分離原理43
• 3.3 結(jié)果與討論43-53
• 3.3.1 Fe_3O_4@PNE NPs的特征43-47
• 3.3.2 Fe_3O_4@PNE NPs填充PDMS微芯片的電滲流47
• 3.3.3 分析物的電化學(xué)行為47-48
• 3.3.4 印跡變量和分離條件的優(yōu)化48-50
• 3.3.5 手性化合物的拆分50-53
• 3.4 系統(tǒng)的定量評(píng)價(jià)和重現(xiàn)性53-54
• 3.5 結(jié)論54-55
• 第4章 磁性功能化PDMS通道的蛋白激酶活性分析方法55-67
• 4.1 引言55-57
• 4.2 實(shí)驗(yàn)部分57-59
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所使用的試劑和主要儀器57-58
• 4.2.2 Fe_3O_4磁性納米粒子的合成58
• 4.2.3 Fe_3O_4@PNE磁性納米粒子的合成58
• 4.2.4 Fe_3O_4@PNE-Ti~(4+) NPs對(duì)PDMS微芯片的修飾58-59
• 4.2.5 細(xì)胞裂解液和樣品的制備59
• 4.2.6 手性分離和檢測(cè)過(guò)程59
• 4.3 結(jié)果與討論59-65
• 4.3.1 Fe_3O_4@PNE-Ti~(4+) NPs的特征59-61
• 4.3.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化61-62
• 4.3.3 多肽樣品的分離62-63
• 4.3.4 對(duì)Fe_3O_4@PNE-Ti~(4+) NPs填充PDMS微芯片的電滲流性能研究63-64
• 4.3.5 PKA活性分析64-65
• 4.3.6 復(fù)雜生物樣品中分析PKA活性65
• 4.4 結(jié)論65-67
• 展望67-68
• 致謝68-69
• 參考文獻(xiàn)69-80
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果80

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