遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)顯微鏡可以實(shí)現(xiàn)對(duì)活體生物組織和細(xì)胞的遠(yuǎn)場(chǎng)、無損傷、非侵入及實(shí)時(shí)的探測(cè)和成像,對(duì)生命科學(xué)發(fā)展起著重要的作用。激光掃描共聚焦顯微鏡是目前研究和應(yīng)用最廣泛的設(shè)備之一,同時(shí)也是進(jìn)一步研究受激發(fā)射損耗顯微鏡(stimulated emission of depletion,STED)等超分辨成像技術(shù)的基礎(chǔ)平臺(tái)。軟件控制系統(tǒng)是共聚焦顯微鏡正常工作的核心部件,本論文主要對(duì)激光掃描共聚焦顯微鏡的控制系統(tǒng)進(jìn)行研制,同時(shí)考慮構(gòu)建STED受激發(fā)射損耗顯微鏡的發(fā)展需求,對(duì)軟件控制系統(tǒng)進(jìn)行了設(shè)計(jì)和編寫。本論文研制的成像軟件系統(tǒng)采用模塊化系統(tǒng)設(shè)計(jì)與研制思路,分別實(shí)現(xiàn)了掃描控制模塊、數(shù)據(jù)采集模塊、系統(tǒng)操作模塊、數(shù)據(jù)處理模塊。掃描控制模塊采用三維納米平移臺(tái)實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的移動(dòng),納米平移臺(tái)的控制通過調(diào)用API接口函數(shù)實(shí)現(xiàn)納米級(jí)別的精準(zhǔn)移動(dòng)。在實(shí)驗(yàn)過程中可采用S型掃描方式和Z型掃描方式對(duì)樣品進(jìn)行采樣。數(shù)據(jù)采集模塊采用雪崩光電二極管(avalanche photodiode,APD)作為微弱熒光信號(hào)的探測(cè)器,時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)采集卡(Time-corrected single photon counting,TCSPC)對(duì)光子進(jìn)行計(jì)數(shù),采用一種基于時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)采集卡的原理實(shí)現(xiàn)可控積分時(shí)間的光子采集方法,對(duì)APD輸出的信號(hào)進(jìn)行像素時(shí)間積分。在系統(tǒng)操作模塊中,主要研究內(nèi)容為協(xié)調(diào)時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)采集卡(TCSPC)和三維納米平移臺(tái)的時(shí)間同步控制。數(shù)據(jù)處理模塊對(duì)每個(gè)像素的光子數(shù)據(jù)進(jìn)行實(shí)時(shí)顯示,圖像構(gòu)建和數(shù)據(jù)存儲(chǔ)。本論文自主開發(fā)的一套智能化點(diǎn)掃描成像系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)激光掃描共聚焦成像,協(xié)調(diào)了三維納米平移臺(tái)、TCSPC數(shù)據(jù)采集卡、單光子探測(cè)器的工作,實(shí)現(xiàn)掃描方式、光子數(shù)采集、數(shù)據(jù)存儲(chǔ)、圖像構(gòu)建各功能模塊之間的通訊。貝塞爾光束的光片熒光顯微鏡因高軸向分辨率、寬視場(chǎng)成像等優(yōu)勢(shì),使得貝塞爾光束成為光片熒光顯微成像的重要照明方式,但因?yàn)樨惾麪柟馐妮S向旁瓣較高,引起焦面以外的熒光激發(fā),降低了圖像的信噪比。本文針對(duì)該問題,提出了一種相減成像的方法去除貝塞爾光束的旁瓣,即將具有類似旁瓣分布的擴(kuò)展的實(shí)心貝塞爾光束和環(huán)狀貝塞爾光束對(duì)樣品兩次成像,再使用這兩個(gè)圖像進(jìn)行差分,從而較好的消除了旁瓣,信噪比和對(duì)比度得到改善,圖像質(zhì)量也得到了增強(qiáng)。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TH742.64;TP391.41;TN249
【部分圖文】：

圖 1.1 STED 顯微術(shù)的原理圖，本圖摘自文獻(xiàn)[24]。2．可逆飽和光學(xué)躍遷顯微術(shù)（RESOLFT）可逆飽和光學(xué)躍遷顯微術(shù)（RESOLFT）和受激發(fā)射損耗顯微鏡的光路類似，在實(shí)驗(yàn)中使用可控?zé)晒獾鞍譡25]，例如 asFP595 作為樣品，激發(fā)光和損耗光使熒光蛋白 asFP595 從亮態(tài)到暗態(tài)實(shí)現(xiàn)切換。在光路實(shí)現(xiàn)中，使用激光掃描共聚焦成像系統(tǒng)的激發(fā)光進(jìn)行激發(fā)，添加一路環(huán)形焦斑的淬滅光。如圖 1.2 所示，光控?zé)晒獾鞍?asFP595 使用 568nm 黃光開啟和 458nm 藍(lán)光關(guān)閉熒光[26]。成像的方法是先用黃光采用激光掃描共聚焦方式激發(fā)熒光，再用中心為零點(diǎn)的環(huán)形藍(lán)光光斑，使焦點(diǎn)周邊被照射區(qū)域的熒光分子淬滅至暗態(tài)，只留下中心區(qū)域的熒光發(fā)射區(qū)域[27]。不同于 STED 的是，它可以使用激光功率較低的光強(qiáng)來實(shí)現(xiàn)熒光的淬滅損耗，降低了光漂泊和光毒性。但是 RESOLFT 只適用于特定的熒光蛋白來標(biāo)記，因此，在應(yīng)用方面可選擇的熒光探針比較少。

圖 1.1 STED 顯微術(shù)的原理圖，本圖摘自文獻(xiàn)[24]。2．可逆飽和光學(xué)躍遷顯微術(shù)（RESOLFT）可逆飽和光學(xué)躍遷顯微術(shù)（RESOLFT）和受激發(fā)射損耗顯微鏡的光路類驗(yàn)中使用可控?zé)晒獾鞍譡25]，例如 asFP595 作為樣品，激發(fā)光和損耗光使 asFP595 從亮態(tài)到暗態(tài)實(shí)現(xiàn)切換。在光路實(shí)現(xiàn)中，使用激光掃描共聚焦的激發(fā)光進(jìn)行激發(fā)，添加一路環(huán)形焦斑的淬滅光。如圖 1.2 所示，光控 asFP595 使用 568nm 黃光開啟和 458nm 藍(lán)光關(guān)閉熒光[26]。成像的方法光采用激光掃描共聚焦方式激發(fā)熒光，再用中心為零點(diǎn)的環(huán)形藍(lán)光光斑周邊被照射區(qū)域的熒光分子淬滅至暗態(tài)，只留下中心區(qū)域的熒光發(fā)射。不同于 STED 的是，它可以使用激光功率較低的光強(qiáng)來實(shí)現(xiàn)熒光的淬滅損了光漂泊和光毒性。但是 RESOLFT 只適用于特定的熒光蛋白來標(biāo)記，因用方面可選擇的熒光探針比較少。

基態(tài)損耗顯微術(shù)（GSD）設(shè)計(jì)合適的光路將熒光團(tuán)擱置在亞穩(wěn)態(tài)狀態(tài)場(chǎng)光學(xué)熒光顯微鏡中突破衍射極限[27-30]。GSD 也是在激光掃描共聚焦基礎(chǔ)上，加入一路損耗光路。首先利用中心零點(diǎn)的環(huán)形損耗光輻照樣周圍的熒光分子激發(fā)至激發(fā)態(tài)，而處于激發(fā)態(tài)上的熒光分子將以一定的間系過渡，躍遷至處于較長壽命的亞穩(wěn)態(tài) T1（三重態(tài)）上。隨后，再束共聚焦激發(fā)光將中心處于基態(tài)的熒光分子激發(fā)到激發(fā)態(tài)，將熒光發(fā)射斑中心附近，從而壓縮了熒光光斑的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（point spread fu，實(shí)現(xiàn)超分辨成像。GSD 的能級(jí)轉(zhuǎn)換如圖 1.3（a）所示，激發(fā)光和于一個(gè)波長，先用中心零點(diǎn)光強(qiáng)的環(huán)形損耗光將熒光由基態(tài)0S 激發(fā)到，由于激發(fā)態(tài)上的熒光分子會(huì)以一定概率躍遷至亞穩(wěn)態(tài) T1上，經(jīng)過很反復(fù)激發(fā)使得熒光分子再由 S1→T1，處于亞穩(wěn)態(tài) T1上的時(shí)間長達(dá) 1-1耗光使環(huán)形區(qū)域內(nèi)的熒光處于暗態(tài)的期間，再用共聚焦激發(fā)光斑輻射使區(qū)域的熒光發(fā)光，從而壓縮熒光的 PSF。GSD 顯微系統(tǒng)的超分辨成像 1.4（b）所示，表明系統(tǒng) PSF 的半高全寬（FWHM）為從共聚焦成像 210nm 壓縮至 90nm。

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