發(fā)布時間：2020-09-27 11:07

　　 遠場光學顯微鏡可以實現(xiàn)對活體生物組織和細胞的遠場、無損傷、非侵入及實時的探測和成像,對生命科學發(fā)展起著重要的作用。激光掃描共聚焦顯微鏡是目前研究和應用最廣泛的設備之一,同時也是進一步研究受激發(fā)射損耗顯微鏡(stimulated emission of depletion,STED)等超分辨成像技術的基礎平臺。軟件控制系統(tǒng)是共聚焦顯微鏡正常工作的核心部件,本論文主要對激光掃描共聚焦顯微鏡的控制系統(tǒng)進行研制,同時考慮構建STED受激發(fā)射損耗顯微鏡的發(fā)展需求,對軟件控制系統(tǒng)進行了設計和編寫。本論文研制的成像軟件系統(tǒng)采用模塊化系統(tǒng)設計與研制思路,分別實現(xiàn)了掃描控制模塊、數(shù)據采集模塊、系統(tǒng)操作模塊、數(shù)據處理模塊。掃描控制模塊采用三維納米平移臺實現(xiàn)對樣品的移動,納米平移臺的控制通過調用API接口函數(shù)實現(xiàn)納米級別的精準移動。在實驗過程中可采用S型掃描方式和Z型掃描方式對樣品進行采樣。數(shù)據采集模塊采用雪崩光電二極管(avalanche photodiode,APD)作為微弱熒光信號的探測器,時間相關單光子計數(shù)采集卡(Time-corrected single photon counting,TCSPC)對光子進行計數(shù),采用一種基于時間相關單光子計數(shù)采集卡的原理實現(xiàn)可控積分時間的光子采集方法,對APD輸出的信號進行像素時間積分。在系統(tǒng)操作模塊中,主要研究內容為協(xié)調時間相關單光子計數(shù)采集卡(TCSPC)和三維納米平移臺的時間同步控制。數(shù)據處理模塊對每個像素的光子數(shù)據進行實時顯示,圖像構建和數(shù)據存儲。本論文自主開發(fā)的一套智能化點掃描成像系統(tǒng),實現(xiàn)激光掃描共聚焦成像,協(xié)調了三維納米平移臺、TCSPC數(shù)據采集卡、單光子探測器的工作,實現(xiàn)掃描方式、光子數(shù)采集、數(shù)據存儲、圖像構建各功能模塊之間的通訊。貝塞爾光束的光片熒光顯微鏡因高軸向分辨率、寬視場成像等優(yōu)勢,使得貝塞爾光束成為光片熒光顯微成像的重要照明方式,但因為貝塞爾光束的軸向旁瓣較高,引起焦面以外的熒光激發(fā),降低了圖像的信噪比。本文針對該問題,提出了一種相減成像的方法去除貝塞爾光束的旁瓣,即將具有類似旁瓣分布的擴展的實心貝塞爾光束和環(huán)狀貝塞爾光束對樣品兩次成像,再使用這兩個圖像進行差分,從而較好的消除了旁瓣,信噪比和對比度得到改善,圖像質量也得到了增強。
【學位單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：TH742.64;TP391.41;TN249
【部分圖文】：

圖 1.1 STED 顯微術的原理圖，本圖摘自文獻[24]。2．可逆飽和光學躍遷顯微術（RESOLFT）可逆飽和光學躍遷顯微術（RESOLFT）和受激發(fā)射損耗顯微鏡的光路類似，在實驗中使用可控熒光蛋白[25]，例如 asFP595 作為樣品，激發(fā)光和損耗光使熒光蛋白 asFP595 從亮態(tài)到暗態(tài)實現(xiàn)切換。在光路實現(xiàn)中，使用激光掃描共聚焦成像系統(tǒng)的激發(fā)光進行激發(fā)，添加一路環(huán)形焦斑的淬滅光。如圖 1.2 所示，光控熒光蛋白 asFP595 使用 568nm 黃光開啟和 458nm 藍光關閉熒光[26]。成像的方法是先用黃光采用激光掃描共聚焦方式激發(fā)熒光，再用中心為零點的環(huán)形藍光光斑，使焦點周邊被照射區(qū)域的熒光分子淬滅至暗態(tài)，只留下中心區(qū)域的熒光發(fā)射區(qū)域[27]。不同于 STED 的是，它可以使用激光功率較低的光強來實現(xiàn)熒光的淬滅損耗，降低了光漂泊和光毒性。但是 RESOLFT 只適用于特定的熒光蛋白來標記，因此，在應用方面可選擇的熒光探針比較少。

圖 1.1 STED 顯微術的原理圖，本圖摘自文獻[24]。2．可逆飽和光學躍遷顯微術（RESOLFT）可逆飽和光學躍遷顯微術（RESOLFT）和受激發(fā)射損耗顯微鏡的光路類驗中使用可控熒光蛋白[25]，例如 asFP595 作為樣品，激發(fā)光和損耗光使 asFP595 從亮態(tài)到暗態(tài)實現(xiàn)切換。在光路實現(xiàn)中，使用激光掃描共聚焦的激發(fā)光進行激發(fā)，添加一路環(huán)形焦斑的淬滅光。如圖 1.2 所示，光控 asFP595 使用 568nm 黃光開啟和 458nm 藍光關閉熒光[26]。成像的方法光采用激光掃描共聚焦方式激發(fā)熒光，再用中心為零點的環(huán)形藍光光斑周邊被照射區(qū)域的熒光分子淬滅至暗態(tài)，只留下中心區(qū)域的熒光發(fā)射。不同于 STED 的是，它可以使用激光功率較低的光強來實現(xiàn)熒光的淬滅損了光漂泊和光毒性。但是 RESOLFT 只適用于特定的熒光蛋白來標記，因用方面可選擇的熒光探針比較少。

基態(tài)損耗顯微術（GSD）設計合適的光路將熒光團擱置在亞穩(wěn)態(tài)狀態(tài)場光學熒光顯微鏡中突破衍射極限[27-30]。GSD 也是在激光掃描共聚焦基礎上，加入一路損耗光路。首先利用中心零點的環(huán)形損耗光輻照樣周圍的熒光分子激發(fā)至激發(fā)態(tài)，而處于激發(fā)態(tài)上的熒光分子將以一定的間系過渡，躍遷至處于較長壽命的亞穩(wěn)態(tài) T1（三重態(tài)）上。隨后，再束共聚焦激發(fā)光將中心處于基態(tài)的熒光分子激發(fā)到激發(fā)態(tài)，將熒光發(fā)射斑中心附近，從而壓縮了熒光光斑的點擴散函數(shù)（point spread fu，實現(xiàn)超分辨成像。GSD 的能級轉換如圖 1.3（a）所示，激發(fā)光和于一個波長，先用中心零點光強的環(huán)形損耗光將熒光由基態(tài)0S 激發(fā)到，由于激發(fā)態(tài)上的熒光分子會以一定概率躍遷至亞穩(wěn)態(tài) T1上，經過很反復激發(fā)使得熒光分子再由 S1→T1，處于亞穩(wěn)態(tài) T1上的時間長達 1-1耗光使環(huán)形區(qū)域內的熒光處于暗態(tài)的期間，再用共聚焦激發(fā)光斑輻射使區(qū)域的熒光發(fā)光，從而壓縮熒光的 PSF。GSD 顯微系統(tǒng)的超分辨成像 1.4（b）所示，表明系統(tǒng) PSF 的半高全寬（FWHM）為從共聚焦成像 210nm 壓縮至 90nm。

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本文編號：2827787