本文關(guān)鍵詞：陽(yáng)離子聚合物修飾的硅納米線陣列在基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： 陽(yáng)離子聚合物 硅納米線陣列 表面修飾 生物相容性 基因轉(zhuǎn)染

【摘要】：基因轉(zhuǎn)染可用于治療或緩解多種疾病,已成為基礎(chǔ)和臨床研究中不可缺少的醫(yī)療手段�；蜣D(zhuǎn)染的關(guān)鍵問題在于選擇安全高效的基因載體和轉(zhuǎn)染方法,將核酸物質(zhì)直接運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核內(nèi)并高效表達(dá),這也是目前基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的瓶頸所在。非病毒型高分子化合物作為基因載體可以在一定程度上提高基因轉(zhuǎn)染的效率和安全性,其中陽(yáng)離子聚合物具有易于合成、便于改性且可攜帶較多DNA進(jìn)入細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn),被廣泛用作基因轉(zhuǎn)染的基因載體。然而陽(yáng)離子聚合物很難輔助DNA直接進(jìn)入細(xì)胞核,轉(zhuǎn)染效率無法進(jìn)一步提高。同時(shí),陽(yáng)離子聚合物在細(xì)胞內(nèi)易大量累積并干擾細(xì)胞的正常代謝過程而產(chǎn)生細(xì)胞毒性。這些缺點(diǎn)極大地限制了陽(yáng)離子聚合物在臨床上的應(yīng)用。硅納米線陣列(SN)可以在保持細(xì)胞活性的同時(shí)刺穿細(xì)胞膜甚至細(xì)胞核膜,攜帶諸多生物因子進(jìn)入細(xì)胞乃至細(xì)胞核。且SN具有較好生物相容性,可支持多種細(xì)胞的培養(yǎng)。然而,由于未經(jīng)修飾的SN表面存在硅的氧化層,因此導(dǎo)致DNA負(fù)載量較低,限制了其在基因轉(zhuǎn)染領(lǐng)域的應(yīng)用。本論文提出了構(gòu)建以陽(yáng)離子聚合物修飾的硅納米線陣列作為基因轉(zhuǎn)染的材料平臺(tái)并輔以提高負(fù)載量和促進(jìn)表達(dá)等手段的復(fù)合基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)策略,旨在綜合利用硅納米線對(duì)細(xì)胞核的直接刺穿作用和陽(yáng)離子聚合物載體對(duì)核酸的有效結(jié)合與釋放作用,來提高基因轉(zhuǎn)染的效率并盡可能地降低細(xì)胞毒性。具體研究?jī)?nèi)容如下:首先,構(gòu)建了一系列核酸載體陽(yáng)離子聚合物修飾的硅納米線陣列。通過化學(xué)修飾的方法將25 kDa的支化聚乙烯亞胺(PEI)和聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(PDMAEMA)接枝到硅納米線陣列表面得到PEI修飾的硅納米線陣列(SN-PEI)和PDMAEMA修飾的硅納米線陣列(SN-PDM);為進(jìn)一步發(fā)揮DNA的負(fù)載和釋放效果及細(xì)胞在材料表面的黏附及脫附,在SN-PDM中引入聚(N-異丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)鏈段獲得聚(N-異丙基丙烯酰胺-甲基丙烯酸氨基乙酯)(PNIPAAmco-PDM)修飾的硅納米線陣列(SN-PNIPAAm-PDM)。借助水接觸角測(cè)試、掃描電子顯微鏡(SEM)、透射電子顯微鏡(TEM)等手段確定了聚合物的成功接枝并系統(tǒng)地表征了材料的表面特性。同時(shí)進(jìn)一步深入考察了這三種基因轉(zhuǎn)染的材料平臺(tái)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SN-PEI和SN-PDM表面能黏附較多的細(xì)胞并實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的良好鋪展和增殖,表明pei和pdmaema對(duì)sn的修飾能夠有效提高材料的生物相容性,具有被進(jìn)一步用作基因轉(zhuǎn)染材料平臺(tái)的潛力和優(yōu)勢(shì)。而sn-pnipaam-pdm表面無法維持細(xì)胞的正�；钚�,生物相容性較差,不適合被用作轉(zhuǎn)染材料。在此基礎(chǔ)上,我們提出了由高效核酸結(jié)合型載體聚乙烯亞胺(pei)接枝修飾的硅納米線陣列(sn-pei)作為基因轉(zhuǎn)染材料平臺(tái),并輔以生物相容性較好的小分子量pei與dna的復(fù)合物的轉(zhuǎn)染體系策略以提高dna在材料表面上的負(fù)載量從而促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染效率和安全性。探討并系統(tǒng)地考察了sn-pei表面氨基密度、dna在材料表面孵育時(shí)間以及轉(zhuǎn)染復(fù)合物中小分子pei與dna的n/p比(pei中的氮原子與dna中磷原子的摩爾比)對(duì)基因轉(zhuǎn)染效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)將n/p比為80的小分子pei(2kda)與dna的混合物孵育在25kdapei接枝時(shí)間為3h的sn-pei表面10min后,體系可實(shí)現(xiàn)最大的轉(zhuǎn)染效率。這一策略有效地提高了基因的轉(zhuǎn)染效率并降低了轉(zhuǎn)染體系的細(xì)胞毒性,然而仍存在一些問題亟需解決,如高分子量pei可能存在潛在的細(xì)胞毒性、體系中dna的負(fù)載量較低還需補(bǔ)加小分子量pei與dna的復(fù)合物。為構(gòu)建更加高效和安全的基因轉(zhuǎn)染體系,有效提高基因在進(jìn)入細(xì)胞核后的表達(dá),我們進(jìn)一步提出了以pdmaema修飾的硅納米線陣列為材料平臺(tái),輔以傳統(tǒng)的鈣離子依賴型轉(zhuǎn)染體系的集成策略,以充分利用材料平臺(tái)和鈣離子依賴型轉(zhuǎn)染體系的優(yōu)點(diǎn),獲得安全、高效負(fù)載和高量表達(dá)的基因轉(zhuǎn)染途徑。pdmaema具有比pei更好的生物相容性,傳統(tǒng)鈣離子依賴型轉(zhuǎn)染體系能夠有效促進(jìn)dna的胞內(nèi)釋放和表達(dá)。研究結(jié)果表明當(dāng)鈣離子濃度為100mm、鈣離子與dna的復(fù)合物在sn-pdm表面的孵育時(shí)間與為20min,pdmaema聚合時(shí)間為24h的sn-pdm能夠?qū)崿F(xiàn)基因高效率的轉(zhuǎn)染和表達(dá)。這個(gè)集成策略為基因傳遞提供了一種嶄新的思路,有望在醫(yī)學(xué)研究和臨床治療中進(jìn)一步廣泛應(yīng)用。綜上所述,在生物相容性好且能夠直接作用于細(xì)胞核的硅納米線陣列表面引入高效的基因載體陽(yáng)離子聚合物pei與pdmaema構(gòu)建的陽(yáng)離子聚合物修飾的硅納米線陣列是基因轉(zhuǎn)染的有效的材料平臺(tái),這種平臺(tái)不僅能夠支持細(xì)胞的黏附和正常生長(zhǎng)增殖,同時(shí)能夠包容多種傳統(tǒng)的、安全的基因轉(zhuǎn)染方法,最終實(shí)現(xiàn)高效的,集成的,安全的基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)。這種以陽(yáng)離子聚合物修飾的硅納米線陣列為材料平臺(tái)的復(fù)合基因轉(zhuǎn)染體系有望為構(gòu)建新型基因轉(zhuǎn)染材料和藥物輸送體系提供高效的平臺(tái)和嶄新的思路。
【關(guān)鍵詞】：陽(yáng)離子聚合物 硅納米線陣列 表面修飾 生物相容性 基因轉(zhuǎn)染
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：TB383.1;R450
【目錄】：

• 摘要4-7
• abstract7-14
• 第一章 緒論14-29
• 1.1 基因治療概述14-15
• 1.2 基因轉(zhuǎn)染載體15-24
• 1.3 表面輔助基因轉(zhuǎn)染24-26
• 1.4 課題的提出26-29
• 第二章 功能化硅納米線陣列對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響的研究29-53
• 2.1 引言29-30
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分30-42
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材30-32
• 2.2.2 溶液配制32
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器32-33
• 2.2.4 硅納米線陣列的制備33-34
• 2.2.5 PEI修飾的硅納米線陣列的制備34-37
• 2.2.6 PDMAEMA修飾的硅納米線陣列的制備37-38
• 2.2.7 PNIPAAm-co-PDM修飾的硅納米線陣列的制備38-39
• 2.2.8 材料的生物相容性39-42
• 2.3 結(jié)果及討論42-52
• 2.3.1 PEI修飾的硅納米線陣列的表征42-46
• 2.3.2 PDMAEMA修飾的硅納米線陣列的表征46-48
• 2.3.3 PNIPAAm-co-PDM修飾的硅納米線陣列的表征48-49
• 2.3.4 功能化硅納米線陣列對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響49-52
• 2.4 本章小結(jié)52-53
• 第三章 PEI修飾的硅納米線陣列用于基因轉(zhuǎn)染53-72
• 3.1 引言53-54
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分54-59
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材54-56
• 3.2.2 相關(guān)試劑的配制56-58
• 3.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器58-59
• 3.3 實(shí)驗(yàn)步驟59-64
• 3.3.1 質(zhì)粒DNA的提取及純化59-60
• 3.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)60-61
• 3.3.3 PEI接枝的硅納米線陣列61-63
• 3.3.4 基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)63-64
• 3.3.5 添加小分子PEI與DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)64
• 3.4 結(jié)果與討論64-71
• 3.4.1 質(zhì)粒pRL-CMV的提取結(jié)果64-65
• 3.4.2 PEI修飾的硅納米線陣列用于基因轉(zhuǎn)染65-67
• 3.4.3 PEI修飾的硅納米線陣列與外源的小分子量PEI-DNA復(fù)合物協(xié)同作用對(duì)基因轉(zhuǎn)染效率的影響67-69
• 3.4.4 影響基因轉(zhuǎn)染體系效率的因素69-71
• 3.5 本章小結(jié)71-72
• 第四章 PDMAEMA修飾的硅納米線陣列用于基因轉(zhuǎn)染72-86
• 4.1 引言72-74
• 4.2 實(shí)驗(yàn)步驟74-77
• 4.2.1 試劑及耗材74-75
• 4.2.2 溶液配制75-76
• 4.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器76-77
• 4.3 實(shí)驗(yàn)步驟77-79
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論79-85
• 4.4.1 SN-PDM表面性質(zhì)表征79-81
• 4.4.2 PDMAEMA修飾的硅納米線陣列用于基因轉(zhuǎn)染81-82
• 4.4.3 影響轉(zhuǎn)染體系效率的因素82-85
• 4.5 本章小結(jié)85-86
• 第五章 結(jié)論與展望86-88
• 5.1 結(jié)論86-87
• 5.2 展望87-88
• 參考文獻(xiàn)88-104
• 碩士論文工作期間科研成果104-105
• 致謝105-107

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