本文關(guān)鍵詞：脫堿基位點(diǎn)DNA分子信標(biāo)和功能化納米金簇的構(gòu)建及生物應(yīng)用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本論文主要研究脫堿基位點(diǎn)DNA分子信標(biāo)和功能化納米金簇的構(gòu)建及其生物應(yīng)用。首先,本工作在DNA中設(shè)計(jì)嵌入脫堿基位點(diǎn),通過改變DNA序列組裝不同的分子信標(biāo),實(shí)現(xiàn)了對三聚氰胺和β淀粉樣蛋白的選擇性及靈敏檢測。金納米團(tuán)簇具有毒性低且熒光性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn),因而可作為藥物輸送的有效載體。通過對金納米團(tuán)簇的表面進(jìn)行修飾,本工作實(shí)現(xiàn)了對siRNA的有效載送及釋放,具有很好的臨床治療應(yīng)用前景。本文的具體研究內(nèi)容如下：第一章緒論本章首先分類介紹了分子信標(biāo),并詳細(xì)闡述了它的生物分析應(yīng)用。簡單地介紹了脫堿基位點(diǎn)的合成方法以及它與小分子之間的結(jié)合。此外,鏈取代放大反應(yīng)的原理與生物應(yīng)用也在本章中作了重點(diǎn)介紹,而后還闡述了多種合成金納米團(tuán)簇的方法及其生物應(yīng)用,最后對本論文的工作目的和意義做了表述。第二章基于含脫堿基位點(diǎn)(AP site)的三鏈分子信標(biāo)對三聚氰胺的靈敏檢測分析本工作基于三聚氰胺與胸腺嘧啶間的氫鍵作用及以堿基配對為基礎(chǔ)的核酸分子識別功能,構(gòu)建了含脫堿基位點(diǎn)的三鏈分子信標(biāo),用于對三聚氰胺的識別和定量檢測。三聚氰胺為含氮量很高的常用工業(yè)原料,單獨(dú)存在時(shí)毒性較低,然而與氰尿酸反應(yīng)后會生成不溶物,因此食品和水源中過量的三聚氰胺會導(dǎo)致腎部結(jié)石并誘發(fā)膀胱癌,對動物和人體造成很大危害。因此,發(fā)展能夠識別和定量檢測三聚氰胺的有效方法變得尤為重要。本工作設(shè)計(jì)了能特異識別三聚氰胺的適配體,該適配體包括兩端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的長鏈DNA和嵌有脫堿基位點(diǎn)的短鏈DNA。三聚氰胺存在時(shí),它可嵌入到短鏈DNA的脫堿基位點(diǎn)中,誘導(dǎo)兩條單獨(dú)的分子信標(biāo)鏈形成特定的三鏈結(jié)構(gòu),引起熒光信號的改變,由此實(shí)現(xiàn)對三聚氰胺的識別和定量檢測。通過優(yōu)化分子信標(biāo)的堿基數(shù)目、反應(yīng)溫度等,對三聚氰胺的檢測限能夠達(dá)到0.3μM。第三章‘基于含脫堿基位點(diǎn)的分子信標(biāo)無酶循環(huán)放大策略用于DNA和β淀粉樣蛋白的分析本工作將無標(biāo)記的分子信標(biāo)與循環(huán)放大策略相結(jié)合,實(shí)現(xiàn)了對DNA及Aβ低聚物簡單及高選擇性的檢測。p淀粉樣低聚物是p淀粉樣蛋白(Aβ)聚集過程中產(chǎn)生的一種有毒物質(zhì),它可作為治療阿爾茨海默癥的潛在目標(biāo)物。兩種含脫堿基位點(diǎn)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA鏈分別構(gòu)成無標(biāo)記的分子信標(biāo)MB1和MB2,熒光分子2-amino-5,6,7-trimethyl-1,8-naph-thyridine (ATMND)通過氫鍵作用可嵌入到分子信標(biāo)的脫堿基位點(diǎn)中,引起ATMND熒光的淬滅。加入目標(biāo)DNA鏈后,該鏈可依次循環(huán)打開MB1和MB2,從而不斷地釋放熒光分子ATMND,因此,10 nM的目標(biāo)DNA鏈便可產(chǎn)生明顯的熒光增強(qiáng)的信號響應(yīng)。將目標(biāo)DNA鏈設(shè)計(jì)為Aβ低聚物的適配體序列,并重新設(shè)計(jì)相應(yīng)的分子信標(biāo)序列,可實(shí)現(xiàn)對Aβ低聚物的高選擇性及定量檢測,并可成功監(jiān)測Ap由單體到低聚態(tài)再到纖維態(tài)的整個聚集過程。第四章陽離子化熒光金納米簇載藥體系的構(gòu)建與表征本工作將毒性低且熒光性質(zhì)穩(wěn)定的金納米團(tuán)簇作為輸送siRNA的有效載體,實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)siRNA的有效運(yùn)輸及釋放。Small interfering RNA (siRNA)是一種小型RNA分子,具有抑制基因表達(dá)的特殊功能,因而是疾病治療中最常使用的藥物之一。傳統(tǒng)的siRNA載藥體系載送效率低,細(xì)胞毒性高且無法實(shí)現(xiàn)熒光成像,這使得基于siRNA的疾病治療應(yīng)用受到了限制。本課題為了克服傳統(tǒng)載藥體系的不足,發(fā)展了一種新型的熒光納米載藥體系。該體系將陽離子化的熒光金納米簇(DMA/EDA-BSA-Au)作為載體,同時(shí)實(shí)現(xiàn)了熒光成像及診斷治療。基于BSA的酸降解特性,該DMA/EDA-BSA-Au復(fù)合物輸送siRNA的過程受到pH的調(diào)控。該載藥體系可將siRNA輸送到肺癌細(xì)胞中,引起GFP基因表達(dá)顯著降低。因此,陽離子化的金納米簇可作為輸送siRNA的有效載體,在各種基于siRNA的疾病治療中存在潛在的應(yīng)用。
【關(guān)鍵詞】：脫堿基位點(diǎn) 分子信標(biāo) 循環(huán)放大 siRNA 金納米團(tuán)簇
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：TB383.1
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 第一章 緒論13-34
• 第一節(jié) 分子信標(biāo)概論13-19
• 1.1 分子信標(biāo)簡介13-17
• 1.2 分子信標(biāo)的生物分析應(yīng)用17-19
• 第二節(jié) DNA脫堿基位點(diǎn)及其應(yīng)用研究19-21
• 2.1 DNA脫堿基位點(diǎn)的形成19
• 2.2 DNA脫堿基位點(diǎn)性質(zhì)19-21
• 第三節(jié) 鏈取代放大反應(yīng)的原理及應(yīng)用21-24
• 3.1 鏈取代放大反應(yīng)(SDA)的原理21
• 3.2 鏈取代反應(yīng)的生物應(yīng)用21-24
• 第四節(jié) 金納米團(tuán)簇及其生物應(yīng)用24-29
• 4.1 金屬納米團(tuán)簇簡介24
• 4.2 金納米團(tuán)簇的合成及其生物應(yīng)用24-29
• 第五節(jié) 本論文的工作和意義29-30
• 參考文獻(xiàn)30-34
• 第二章 基于含脫堿基位點(diǎn)(AP site)的三鏈分子信標(biāo)對三聚氰胺的靈敏檢測分析34-46
• 1 引言34-35
• 2 實(shí)驗(yàn)部分35-36
• 2.1 材料與試劑35-36
• 2.2 儀器與設(shè)備36
• 2.3 三聚氰胺檢測實(shí)驗(yàn)36
• 3 結(jié)果與討論36-43
• 3.1 三鏈分子信標(biāo)的形成及檢測三聚氰胺實(shí)驗(yàn)原理36-37
• 3.2 條件優(yōu)化37-40
• 3.3 分子信標(biāo)的表征40-41
• 3.4 三聚氰胺的檢測41-43
• 4 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-46
• 第三章 基于含脫堿基位點(diǎn)的分子信標(biāo)無酶循環(huán)放大策略用于DNA和β淀粉樣蛋白的分析46-61
• 1 引言46-47
• 2 實(shí)驗(yàn)部分47-49
• 2.1 材料與試劑47-48
• 2.2 儀器與設(shè)備48
• 2.3 低聚態(tài)及纖維態(tài)Aβ的制備48-49
• 2.4 無酶放大檢測實(shí)驗(yàn)49
• 3 結(jié)果與討論49-58
• 3.1 無標(biāo)記及無酶放大檢測實(shí)驗(yàn)原理49-50
• 3.2 無需標(biāo)記的含AP位點(diǎn)的分子信標(biāo)體系50-51
• 3.3 無需酶的放大反應(yīng)51-53
• 3.4 特異性研究53-54
• 3.5 Aβ低聚物的測定54-57
• 3.6 監(jiān)測Aβ的聚集過程57-58
• 4 結(jié)論58-59
• 參考文獻(xiàn)59-61
• 第四章 陽離子化熒光金納米簇載藥體系的構(gòu)建與表征61-74
• 1 引言61-62
• 2 實(shí)驗(yàn)部分62-64
• 2.1 材料與試劑63
• 2.2 金納米簇的合成63
• 2.3 金納米簇的陽離子化63
• 2.4 粒子尺寸及表面電荷測量63-64
• 2.5 電泳分析64
• 2.6 細(xì)胞培養(yǎng)64
• 2.7 體外細(xì)胞攝取復(fù)合物及其分布實(shí)驗(yàn)64
• 3 結(jié)果與討論64-71
• 3.1 DMA/EDA-BSA-Au復(fù)合物的合成及siRNA負(fù)載原理64-65
• 3.2 DMA/EDA-BSA-Au復(fù)合物的表征65-69
• 3.3 細(xì)胞對siRNA/GNC復(fù)合物的攝取及分布研究69-70
• 3.4 GFP基因敲除研究70-71
• 4 結(jié)論71-72
• 參考文獻(xiàn)72-74
• 附錄：碩士期間發(fā)表論文情況74-75
• 致謝75

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