在細(xì)胞代謝活動中,多酶級聯(lián)反應(yīng)體系通過將不同類型酶分子精準(zhǔn)、有序地自組裝,形成多酶復(fù)合體,使得酶分子在空間上互相鄰近,形成底物通道,從而増強(qiáng)級聯(lián)酶反應(yīng)的協(xié)同作用和催化效率。模擬和借鑒天然多酶復(fù)合體的組裝策略,構(gòu)建高效、穩(wěn)定的人工多酶納米反應(yīng)器已成為合成生物學(xué)與代謝工程的重要研究方向。但是,由于代謝途徑中酶分子結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性,多酶反應(yīng)器的構(gòu)建仍面臨諸多挑戰(zhàn),如穩(wěn)定性弱、組裝層次較低、可控性差等,嚴(yán)重限制了多酶分子機(jī)器在生物合成中的應(yīng)用。本文針對上述問題,基于SpyCatcher/SpyTag自反應(yīng)共價偶聯(lián)系統(tǒng),選擇氧化還原酶-輔酶循環(huán)體系為模式系統(tǒng),設(shè)計了兼具催化活性和自組裝能力的功能酶分子模塊,并深入研究了多酶體系在二維(2D)和三維(3D)層次的共價組裝和催化性能,以探索新型SpyCatcher/SpyTag共價偶聯(lián)系統(tǒng)在多酶體系構(gòu)建中的應(yīng)用潛力,并開發(fā)高效的納米多酶納米分子機(jī)器用于更多有價值生物產(chǎn)品的合成。具體研究如下:(1)2D輔酶循環(huán)機(jī)器的組裝:寡聚酶廣泛存在于代謝通路中,由于其結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性,多酶系統(tǒng)的有序及穩(wěn)定組裝仍然面臨挑戰(zhàn)。本研究中,我們選擇二聚體的細(xì)胞色素單加氧酶P450BM3突變體(P450BM3m,A74G/F87V/L188Q)和四聚體的葡萄糖脫氫酶(GDH)作為輔酶循環(huán)模式系統(tǒng),基于SpyCatcher/SpyTag的自反應(yīng)共價偶聯(lián)特性和無骨架自組裝技術(shù),構(gòu)建葡萄糖和NADP~+驅(qū)動的輔酶循環(huán)機(jī)器,用于染料靛藍(lán)的高效合成。首先通過基因融合技術(shù)構(gòu)建了具有生物催化和自組裝能力的雙功能催化模塊SpyCatcher-P450BM3m和SpyTag-GDH;將純化的兩個模塊在體外混合,通過SpyCatcher與SpyTag共價偶聯(lián)一步實現(xiàn)了多酶納米反應(yīng)器的自組裝;使用透射電鏡(TEM)、掃描電鏡(SEM)等分析證明多酶反應(yīng)器形成了高度有序的二維納米片層,大小在幾十到幾百個微米;生化實驗分析表明:2D輔酶循環(huán)機(jī)器的催化速率比未組裝多酶混合物提升了2-3倍,同時展現(xiàn)出更好的熱穩(wěn)定性、儲藏穩(wěn)定性及可反復(fù)使用性。(2)3D輔酶循環(huán)機(jī)器的可控組裝:鑒于3D層次的多酶催化劑具有更高效的中間產(chǎn)物傳輸效率等潛在優(yōu)勢,我們探索了將具有3D拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的大腸桿菌DNA結(jié)合蛋白(DNA binding protein,Dps)與SpyCatcher/SpyTag系統(tǒng)相結(jié)合的新型3D輔酶循環(huán)機(jī)器構(gòu)建。我們選擇乙醛還原酶(ALR)和甲酸脫氫酶(FDH)構(gòu)成輔酶循環(huán)系統(tǒng)、以期使用廉價底物甲酸和4-氯乙酰乙酸乙酯合成藥物手性砌塊分子4-氯-3羥基丁酸乙酯((R)-CHBE)。首先將大腸桿菌DNA結(jié)合蛋白Dps骨架蛋白和SpyCatcher/SpyTag相互作用元件分別與兩個酶進(jìn)行融合,構(gòu)建了三元件SpyTag-Dps-ALR融合蛋白和二元件SpyCatcher-FDH融合蛋白;凝膠排阻色譜(SEC)、電泳遷移實驗(EMSA)、以及TEM等研究結(jié)果表明:三元件融合蛋白SpyTag-Dps-ALR在大腸桿菌中成功自組裝為單分散的3D建筑模塊。通過在體外與SpyCatcher-FDH混合,可一步實現(xiàn)雙酶模塊在三維空間的自組裝。組裝模式分析表明:1分子SpyTag-Dps-ALR最多可以與12分子的SpyCatcher-FDH進(jìn)行組裝;使用AFM對組裝體結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,表明兩個融合蛋白模塊在SpyCatcher/SpyTag相互作用的驅(qū)動下,沿三維方向生長,形成微米級的3D超分子催化網(wǎng)絡(luò);對組裝體的催化性能進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn):1)在甲酸和NADP~+驅(qū)動下,能有效實現(xiàn)輔酶再生并合成R-CHBE;2)使用輔因子NADP~+進(jìn)行合成反應(yīng)比使用NADPH具有更高的輔酶循環(huán)優(yōu)勢;3)SpyTag-Dps-ALR與SpyCatcher-FDH組裝比為1:12時形成的納米反應(yīng)器,將輔酶循環(huán)效率提高了10倍;4)多酶催化劑具有良好的反復(fù)使用能力,反復(fù)使用6次具有80%以上活力;使用10次后仍具有50%以上活力。表明3D輔酶循環(huán)機(jī)器通過可控自組裝可以實現(xiàn)高效的輔酶循環(huán)和產(chǎn)物合成。本研究首次探索了SpyCatcher/SpyTag化學(xué)在多酶催化領(lǐng)域的應(yīng)用。成功構(gòu)建了具有2D結(jié)構(gòu)的氧化還原酶-輔酶循環(huán)機(jī)器,證明SpyCatcher/SpyTag系統(tǒng)與多亞基蛋白具有良好兼容性,為發(fā)展穩(wěn)定、高效的多酶反應(yīng)器提供了新的策略。本研究所構(gòu)建的3D輔酶循環(huán)機(jī)器,實現(xiàn)了多酶體系在三維空間的可控、有序組裝,促進(jìn)了手性化合物的高效、穩(wěn)定合成。證明了Dps蛋白作為空間支架的可行性,本論文所建立的高效、穩(wěn)定、多層次的納米多酶反應(yīng)器的設(shè)計思路,實現(xiàn)了酶分子機(jī)器設(shè)計的模式創(chuàng)新,為重要化合物的高效合成提供了理論和技術(shù)支撐。
【學(xué)位單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：TB383.1;Q814
【部分圖文】：

圖 1.1 聚酮合酶結(jié)構(gòu)示意圖[15]酮基合成酶(Ketosynthase, KS), �；D(zhuǎn)移酶(Acyltransferase, AT), (Acyl Carrier Protein，ACP), 酮基還原酶(Ketoreductase，KR)和(Enoyl Reductase, ER)。Figure 1.1 The structure and mechanism of polyketide synthas纖維素小體（cellulosome）是錨定在厭氧細(xì)菌細(xì)胞壁上的超分子是一個研究較為清楚和成熟的天然多酶催化機(jī)器[17-19]，纖維小體是纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBM）和多拷貝的粘連蛋白 cohesin 結(jié)構(gòu)域組素水解酶類通常含有一個與 cohesin 結(jié)構(gòu)域高度親和的 dockerin cohesin-dockerin 之間的相互作用，將多個纖維素類水解酶組共裝到形成超分子纖維素水解機(jī)器，能夠有效促進(jìn)水解酶類的協(xié)同催化，

圖 1.2 厭氧菌纖維素小體機(jī)器[17]ScaA: 基礎(chǔ)骨架（I 型）；ScaC，ScaD, ScaF：錨定骨架（II 型）；ScaB：接頭骨架； CBM：碳水化合物結(jié)合模塊；GH：糖苷水解酶。Fig 1.2 Natural protein scaffolds from cellulosome研究表明，細(xì)胞代謝活動中的不同功能酶分子可以組裝形成精確有序的多酶催化機(jī)器，通過高度的協(xié)同作用，高效的實現(xiàn)了細(xì)胞生命活動的正常運轉(zhuǎn)，因此深入研究天然多酶復(fù)合體的組裝結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制，通過人工模擬和借鑒，精確的設(shè)計，將多個酶分子組裝成多酶催化機(jī)器，實現(xiàn)高效的協(xié)同催化成為合成生物學(xué)和代謝工程領(lǐng)域富有挑戰(zhàn)性的研究方向之一[20,21]。1.1.2 多酶復(fù)合體的作用機(jī)制目前研究普遍認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)多酶復(fù)合體系整體高效的催化能力可能歸因于[22-26]

上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文phimurium 來源的色氨酸合酶的結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)[27]，該酶以 α2β２四聚體的形式存在，α 亞基催化 3-磷酸甘油吲哚裂解為 3-磷酸甘油醛和吲哚，β 亞基催化吲哚和Ｌ-絲氨酸合成Ｌ-色氨酸。蛋白 α，β 亞基間距離為 25 ,中間有一個疏水底物傳遞通道。在級聯(lián)催化反應(yīng)的不同步驟，通過變構(gòu)調(diào)節(jié)活性位點區(qū)域的開關(guān)，控制底物的運輸和傳遞。為了確認(rèn)該底物通道的存在，研究者從酶反應(yīng)動力學(xué)、蛋白晶體結(jié)構(gòu)等方面入手做了大量研究工作。Ahmed 研究組通過穩(wěn)態(tài)實驗得到了底物通道存在的證據(jù)[28-30]，在色氨酸的合成過程中，只能檢測到微量的吲哚，約為３-磷酸甘油醛濃度的１％，而且檢測不到色氨酸合成的延滯時間。動力學(xué)分析實驗結(jié)果示，吲哚從 α 亞基的活性位點移動到 β 亞基的活性位點，并在 β 亞基上快速轉(zhuǎn)化為 L-色氨酸（圖 1.3）。
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本文編號：2849773