殼聚糖作為一種天然高分子材料,由于其優(yōu)異的生物相容性、生物降解性、抗菌性,以及促傷口愈合能力,被認為是最具應用前景的抗菌材料之一。然而,殼聚糖的水溶性差,只能在酸性條件下溶解并發(fā)揮抗菌作用,這極大的制約了其在生物體環(huán)境中的應用。此外,殼聚糖的抗菌性能較弱,單一的殼聚糖材料較難滿足臨床上復雜的抗菌要求。因此,通常需要將殼聚糖與其他抗菌劑結合以增強其抗菌性能。在眾多抗菌劑中,納米銀由于具有廣譜的抗菌性且無耐藥性問題,成為了研究最為深入、應用最為廣泛的抗菌添加劑之一。但納米銀潛在的細胞毒性問題也一直制約著其在生物體內的應用。本研究擬通過將生物相容性極佳的殼聚糖與抗菌性能極強的納米銀復合,制得兼具強效抗菌與生物無毒的新材料。具體研究成果如下:(1)通過酰胺化反應將小分子鄰苯二酚接枝到殼聚糖分子上,制得了水溶性極佳的改性殼聚糖(CSS),解決了殼聚糖只能在酸性條件下發(fā)揮抗菌作用的問題。利用鄰苯二酚的還原性以及殼聚糖的穩(wěn)定作用,將CSS作為還原劑和穩(wěn)定劑,可一步法制得了粒徑均一且穩(wěn)定性高的復合納米銀(CSS-AgNPs)。這種復合納米銀兼具了殼聚糖與納米銀的雙重優(yōu)點:納米銀賦予了它突出的抗菌性能,而外層包裹的殼聚糖衍生物又使其細胞毒性顯著降低。細胞和細菌實驗證明,CSS-AgNPs在適宜的劑量濃度下,可有效殺滅細菌而不對人體細胞產生毒性作用,有望被應用于生物醫(yī)用領域。(2)針對納米銀和殼聚糖的抗菌機理仍不明確這一問題,我們借助TEM和SEM等顯微成像技術和生化分析技術,深入研究了革蘭氏陰陽細菌被CSS-AgNPs作用后的微觀形態(tài)學變化,揭示了 CSS-AgNPs具體的抗菌作用機理。研究發(fā)現,CSS-AgNPs對革蘭氏陰性菌的殺菌性能明顯強于陽性菌。這種特異性的抗菌作用與革蘭氏陰陽兩種細菌不同的細胞壁結構相關。CSS-AgNPs殺死陰性菌的關鍵在于破壞其致密且厚的細胞壁,而對細胞膜通透性的破壞是革蘭氏陰性菌被殺死的主要機理。(3)利用CSS-AgNPs表面的兒茶酚基團與殼聚糖凝膠網絡中的氨基形成相互作用,可將CSS-AgNPs牢牢地固定在殼聚糖海綿的內部以實現納米銀的緩釋。這種新型殼聚糖基載銀復合海綿具有優(yōu)異的長效抑菌性能,可有效抑制革蘭氏陰陽兩種細菌的增殖達到72h以上。同時殺菌性能顯著,有效殺菌率為99.99%。當載銀量在0.63±0.09%時,復合海綿既具有優(yōu)異的殺菌性能和長效抑菌性能,細胞毒性也很低,是一種極具臨床應用前景的抗菌敷料。(4)將帶負電荷的聚噁唑啉衍生物與帶正電荷的CSS-AgNPs進行靜電自組裝,制得具有pH響應性殺菌兼抗粘附性能的多層膜。我們合成了末端為甲氧羰基的噁唑啉單體,將其與末端為乙基的噁唑啉單體,按照一定的投料比聚合,制得了羧基單元比從高到低的三種聚噁唑啉衍生物。羧基的引入使本來不帶電的聚噁唑啉具有了電負性,電荷密度與羧基單元比含量成正比。研究發(fā)現,該靜電自組裝中存在“臨界電荷密度效應”。當聚噁唑啉衍生物的電荷密度小于某臨界值時,組裝無法連續(xù)進行。而當電荷密度超過臨界值時,組裝可以順利進行,且聚電解質的吸附量隨電荷密度的降低而增大。該靜電自組裝多層膜呈指數型增長,這是弱聚電解質在多層膜中“穿插滲透”導致的。接觸角實驗表明,多層膜的最外層為聚噁唑啉衍生物時具有很好的親水性,有望在生物體內發(fā)揮較好的抗細菌粘附效果。體外釋放測試實驗表明,該多層膜具有明顯的酸響應釋放特性。環(huán)境pH的降低會使多層膜中聚噁唑啉上的羧基電離程度減小,其與CSS-AgNPs的作用力減弱,部分納米銀顆粒就會從多層膜中釋放出來。這一特性有望被應用于刺激響應性殺菌領域。
【學位單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：O636.1;TB33
【部分圖文】：

螯合以及絮凝作用，將殼聚糖用于工業(yè)廢水、生活污水的處理Ｕ１］。??１．２．２殼聚糖在生物醫(yī)用領域的應用??除了較強的化學反應活性外，殼聚糖還具有許多優(yōu)良的生物特性（見下圖１．２），具??體表現在以下幾方面（１）作為天然生物高分子，可生物降解，且降解產物無毒無??害，生物相容性好；（２）可與哺乳動物和微生物細胞相結合；（３）促進結締組織的再生，??加速傷口愈合；（４）促進成骨細胞的生成，加速骨再生；（５）具有止血、抗菌、抗腫瘤??等作用。??２??

以促進新生肉芽的形成和大量血管的再生，并具有一定的鎮(zhèn)痛作用［２２］。各類殼聚糖基??衍生物材料以膜、海綿、水凝膠等多種形式，作為傷口敷料申請專利保護并成功投放市??場，如３Ｍ公司研發(fā)生產的Ｔｅｇａｓｏｒｂ和Ｔｅｇａｄｅｒｍ?（詳見下圖１．３），以及美國ＩＭＳ公司??的?Ｃｈｉｔｏｄｉｎｅ?等［８］。??３Ｍ＇?Ｔ＾ａｄｅｒｍ＂?ａｎｄ?Ｔｅｇａｄｅｒｍ＂?ＨＰ??Ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ?Ｄｒｅｓｓｉｎｇｓ??Ｔｈｅ?ｃｌｅａｒ?ｃｈｏｉｃｅ?ｆｏｒ?ｅａｓｙ?ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ?ａｎｄ?ｅｘｔｅｎｄｅｄ?ｗｅａｒ?ｔｉｍｅ??羽嫻＝??圖１．３左圖為殼聚糖基商用止血材料ＣＥＬＯＸ的產品外觀及使用場所示意圖，右圖為殼??聚糖基傷口敷料Ｔｅｇａｄｅｒｍ的產品外觀及適用部位示范圖。??１．２３殼聚糖基抗菌材料的研宄進展??作為一種天然的中性高分子材料，殼聚糖由于其固有的抗菌性能和來源廣泛、產量??高等特點，被認為是最理想的抗菌材料之一，備受國內外學者的關注［９］�，F階段，關于??殼聚糖抗菌作用的確切機制尚無定論，但現有的研究成果正在逐漸揭開這一面紗，新的??猜想不斷被提出并在一定程度上得到了驗證。??有研宄表明，帶正電荷的殼聚糖分子和帶負電荷的微生物細胞膜之間的相互作用會??導致細菌的生物膜發(fā)生破裂，隨后蛋白質和其他細胞內成分會發(fā)生泄漏，進而導致細菌??的死亡［ｉａ２３＿２６］。在較低濃度時，帶正電荷的殼聚糖與帶負電荷的細菌表面結合會導致細??菌的聚集

液的抑菌作用具有濃度依賴性。并觀察到細胞膜對小分子細胞組分的通透性增強與顯著??的細胞膜去極化現象相伴而生。但沒有觀察到阻礙細胞壁生物合成的現象。為了進一步??觀察殼聚糖溶液的作用方式，掃描電鏡被用于觀察細胞的受損情況。結果如下圖１．４所??示，與未經處理的對照組相比（圖１．４ａ），經殼聚糖溶液處理５分鐘后的葡萄球菌表面??就出現了不規(guī)則的突起物（圖１．４ｂ），這可能是帶正電荷的殼聚糖附著在了負電荷的細??菌表面。隨著殼聚糖溶液處理的時間延長至２０分鐘（（圖１．４ｃ），細胞膜的局部開始輕??微地剝離細胞壁，壁膜間形成了小“空泡樣”結構。這可能是胞內的離子和水發(fā)生了外??流，內部壓力降低導致的。但是始終未曾觀察到細胞壁的破裂，細胞膜的物理結構也保??持完整。轉錄響應數據分析顯示，殼聚糖溶液處理后，金黃色葡萄球菌涉及調節(jié)應激和??自溶的ＳＧ５１１基因的表達譜以及與能量代謝相關的基因發(fā)生了多重變化。因此研究人??員推測，殼聚糖與磷壁酸的結合加上膜脂質（主要是脂磷壁酸）的潛在提取引發(fā)了一系??列事件
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本文編號：2841063