隨著全世界癌癥患病率提升及晚期疾病診斷所致的死亡人數(shù)增多,生物傳感器在精準(zhǔn)醫(yī)療、臨床診斷等領(lǐng)域扮演著越來越重要的作用。生物傳感器是由生物感應(yīng)元件和信號處理元件組建起來的一種分析檢測平臺,它具有靈敏度高、專一性強(qiáng)、操作簡單、成本低廉等優(yōu)勢,主要涉及化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、物理學(xué)、微電子學(xué)等學(xué)科,是在交叉學(xué)科的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的,目前已廣泛應(yīng)用到各個領(lǐng)域。其中,核酸和酶生物傳感器因其靈敏度高、能耗少、易微型化等特點,逐漸成為生化分析等交叉領(lǐng)域的熱點課題。核酸生物傳感器主要依賴堿基互補(bǔ)配對原則實現(xiàn)對核酸分子等的分析檢測,比如疾病基因和單堿基突變的檢測及特異性核算序列分析。另外,利用序列特異性核酸與蛋白質(zhì)、小分子等結(jié)合,可以實現(xiàn)對蛋白質(zhì)、小分子等的檢測。酶生物傳感器是基于底物與酶之間特異性反應(yīng)所產(chǎn)生的信號,從而實現(xiàn)對目標(biāo)物的檢測。然而,由于大多數(shù)酶屬于蛋白質(zhì),需要在特定的溫度、pH條件下才能保持其最佳的活性,且個別酶在發(fā)生作用時還需輔酶協(xié)助,因此酶生物傳感器在構(gòu)建過程中需注意實驗條件的選擇。由于此類核酸、酶生物傳感器檢測的目標(biāo)物自身的特性,需結(jié)合復(fù)合納米材料和信號放大策略,才可以實現(xiàn)對痕量或超痕量目標(biāo)物的高靈敏檢測,獲得最優(yōu)的分析檢測性能。本文圍繞光電化學(xué)生物傳感器及相關(guān)研究的關(guān)鍵問題,如穩(wěn)定且高活性的傳感界面構(gòu)筑、信號放大策略設(shè)計,從而實現(xiàn)高靈敏檢測、可再生新型傳感器搭建,利用功能化復(fù)合納米材料并結(jié)合雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、G-wire超級結(jié)構(gòu)、雙酶催化等信號放大技術(shù)制備了一系列新型生物傳感器。本論文旨在開發(fā)構(gòu)筑新的分析檢測平臺,并對其相應(yīng)原理、性能等問題進(jìn)行全面深入地探索,主要研究內(nèi)容及結(jié)論如下:1.基于免金屬催化點擊化學(xué)反應(yīng)構(gòu)建光電化學(xué)核酸生物傳感器的研究眾所周知,光電轉(zhuǎn)換效率與光生電子-空穴對復(fù)合速率密切相關(guān)。本章中,我們基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)合免金屬催化的點擊化學(xué)反應(yīng)設(shè)計的信號放大策略,構(gòu)建了一種新的光電化學(xué)核酸傳感平臺實現(xiàn)對miRNA靈敏檢測。首先,在目標(biāo)物的引發(fā)下,具有炔基修飾的發(fā)夾DNA會在電極基底發(fā)生雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng),形成大量的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。然后,將電子供體多巴胺組裝到有疊氮基團(tuán)修飾的DNA探針上,獲得信號探針P_(DA)-N_3,信號探針P_(DA)-N_3可借助免金屬催化的點擊化學(xué)反應(yīng)鏈接到電極基底,最終實現(xiàn)對miRNA-141的超靈敏檢測,檢出限為27 amol L~(-1)。該方法相對于傳統(tǒng)方法而言,將電子供體直接鏈接在基底上,可以更高效地抑制光生電子空穴重組實現(xiàn)光電信號的高效輸出。首次利用免金屬催化點擊化學(xué)反應(yīng)引入電子供體,簡化固定操作步驟,提高了電子供體利用率。結(jié)合四面體DNA探針,有序可控地實現(xiàn)信號放大策略最終達(dá)到對miRNA分析檢測的目的。2.基于G-wire超級結(jié)構(gòu)的信號增強(qiáng)型光電化學(xué)核酸生物傳感器研究我們利用微乳法制備高效的光電活性材料PtNCs/Cu_3(PO_4)_2NSs并將其用于構(gòu)建“signal on”光電化學(xué)傳感平臺實現(xiàn)對miRNA的精確定量分析。通過微乳法可合成形貌結(jié)構(gòu)可控的Cu_3(PO_4)_2NSs,據(jù)電鏡表征證實其呈超薄片層狀,厚度僅為1.3 nm。憑借紫外光誘導(dǎo)還原方法,以Cu_3(PO_4)_2NSs作為載體,在其上原位生長PtNCs。我們利用成功制備的超薄片層狀PtNCs/Cu_3(PO_4)_2NSs復(fù)合納米材料充當(dāng)光電極材料,用于光電極基底修飾。在光電化學(xué)測試過程中,該復(fù)合納米材料展現(xiàn)出優(yōu)良的光電化學(xué)活性�；贕-wire超級結(jié)構(gòu)信號放大策略,在電極基底成功固載大量的乳酸氧化酶,利用其氧化還原反應(yīng)于電極表面原位產(chǎn)生的電子供體H_2O_2,高效抑制光生電子空穴的重組,實現(xiàn)信號放大,最終達(dá)到超靈敏檢測miRNA-141的目的。此外,利用該光電化學(xué)傳感平臺研究了miRNA-141在22Rv1和HeLa細(xì)胞中的表達(dá)情況。超薄片層狀Pt/Cu_3(PO_4)_2作為一種優(yōu)良的生物相容性材料,在光電化學(xué)中具有巨大的應(yīng)用潛力。因此,這種傳感方法可推廣于光電化學(xué)檢測痕量目標(biāo)物的研究中。3.基于免標(biāo)記off-on模式及G-wire信號放大策略構(gòu)建光電化學(xué)核酸生物傳感器的研究MiRNA是一類內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子,能夠參與動植物中轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。因此,miRNA的準(zhǔn)確定量對于疾病診斷、預(yù)后和治療具有非常重要的意義。然而,因其在機(jī)體內(nèi)的低含量,通常情況下難于對其進(jìn)行精確測定。本章中,我們基于免標(biāo)記off-on模式構(gòu)建了光電化學(xué)生物傳感平臺用于miRNA的定量分析。具體而言,首先借助靜電吸附作用使得帶正電荷的金溶膠與固載在電極表面的DNA“橋型”構(gòu)型結(jié)合,由于金溶膠的表面等離子體共振吸收,能夠獲得“signal-off”的光電流響應(yīng)信號。然后,利用DNA“四通路”構(gòu)型引入目標(biāo)物,與此同時,在核酸內(nèi)切酶Nb.BbvCI輔助下輸出特征c-myc序列,實現(xiàn)G-wire超級結(jié)構(gòu)信號放大策略的構(gòu)建,最后獲得“signal-on”光電流響應(yīng)信號。通過自主設(shè)計目標(biāo)物轉(zhuǎn)換體系,將目標(biāo)物的輸入轉(zhuǎn)換成信號放大結(jié)構(gòu)構(gòu)建單元的輸出,實現(xiàn)了對目標(biāo)物miRNA-141的超靈敏檢測。該新穎的off-on信號轉(zhuǎn)換模式對開發(fā)簡便易行、快速靈敏的新型信號放大策略具有十分重要的意義。4.基于Pd-Au納米線的信號增強(qiáng)型電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器用于乙酰膽堿脂酶的分析我們利用水熱法成功制備了一維鈀金納米線(Pd-Au NWs),將其用作電極材料修飾在電極基底,再結(jié)合雙生物標(biāo)志物識別和雙酶催化的原理構(gòu)建了電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器,并將其用于乙酰膽堿酯酶(AChE)活性的檢測。相對于單一組分的納米線而言,Pd-Au NWs不僅可以提供更大的比表面積用于AChE固定,而且能夠展示出更優(yōu)異的電催化活性和電子轉(zhuǎn)移能力。通過對AChE抑制劑和活化劑的篩選,選出有機(jī)磷和肟類化合物分別充當(dāng)其抑制劑和活化劑,以被抑制活性和再恢復(fù)活性的AChE作為雙生物標(biāo)志物。此外,在雙酶體系A(chǔ)ChE和膽堿氧化酶存在的條件下,硫代乙酰膽堿會在AChE水解作用下產(chǎn)生硫代膽堿,進(jìn)而與膽堿氧化酶發(fā)生氧化還原反應(yīng)原位生成H_2O_2。最終,基于原位產(chǎn)生的H_2O_2作為共反應(yīng)試劑,構(gòu)建了經(jīng)典的魯米諾-H_2O_2電致化學(xué)發(fā)光傳感平臺實現(xiàn)了“signal-on”檢測乙酰膽堿酯酶活性的目的。乙酰膽堿酯酶的檢出限為0.0083 U L~(-1)。此電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器為生化分析中蛋白質(zhì)測定提供了新途徑,具有良好的指導(dǎo)意義。5.基于雙生物標(biāo)志物原理構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器實現(xiàn)靈敏檢測乙酰膽堿酯酶通過水熱法一步合成了長度約為20 nm的鈀納米棒(PdNR),并將其與功能化C_(60)材料(C_(60)-TOAB)進(jìn)行復(fù)合,最終得到復(fù)合納米材料PdNR/C_(60)-TOAB。由于此復(fù)合納米材料在電化學(xué)測試過程中會出現(xiàn)一對特征的C_(60)/C~-_(60)氧化還原峰,且AChE水解會產(chǎn)生具有電催化活性的硫代膽堿,基于此我們利用電化學(xué)檢測技術(shù)聯(lián)合雙生物標(biāo)志物原理構(gòu)建了電化學(xué)生物傳感器。通過引入復(fù)合納米材料作為修飾電極基底材料,降低了體系的氧化電位,促進(jìn)了電極表面電子轉(zhuǎn)移并為后續(xù)AChE的孵育提供了良好的固載平臺,利于電信號的輸出,從而確保此生物傳感器的分析檢測性能。該構(gòu)建的生物傳感器最終實現(xiàn)了對AChE及其抑制劑有機(jī)磷的靈敏檢測。
【學(xué)位單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：TB383.1;TP212.3
【部分圖文】：

化學(xué)生物傳感器構(gòu)建過程示意圖；（B）光電流產(chǎn)生和 miRNA 檢測機(jī)A) Schematic diagram of the fabrication process of the photoelectroc the photocurrent generation mechanism and microRNA detection m

加工、存儲、銷售等過程中的食品衛(wèi)生，可通過食品檢測技術(shù)對食品生產(chǎn)程中的各個環(huán)節(jié)進(jìn)行監(jiān)測從而降低疾病隱患。生物傳感器在環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域?qū)ΡO(jiān)測環(huán)境及實時了解環(huán)境污染情況，從而評估環(huán)境危害性并指導(dǎo)治理方定具有極其重要的意義。生物傳感器可實現(xiàn)對土壤中農(nóng)藥殘留的監(jiān)測；對生物耗氧量的檢測；對空氣中污染氣體如 SO2、NO2等的分析；對環(huán)境中 Hg2+等重金屬離子及多環(huán)芳烴等有機(jī)污染物的檢測。例如，Ren 等[34]通過核酶 III 催化目標(biāo)物 Hg2+的循環(huán)放大，與此同時，體系中釋放出大量 c-myc 序 K+、Mg2+作用下可以形成 G-wire 超級結(jié)構(gòu)。基于此，成功地構(gòu)建了共振射適配體傳感器并實現(xiàn)了對痕量 Hg2+的免標(biāo)記檢測（圖 1.4），最終獲得 檢 出 限 為 2.0 nmol L-1。 Du 等[35]基 于 有 機(jī) 磷 對 乙 酰 膽 堿 酯Acetylcholinesterase，AChE）的抑制作用及酶的水解產(chǎn)物硫代膽堿（ATCl電活性的特點，采用電化學(xué)方法實現(xiàn)了對環(huán)境污染物有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測。感器在科學(xué)研究中的應(yīng)用有力地推動了生物學(xué)的發(fā)展。Ray 等[36]應(yīng)用生物對大量 RNA 結(jié)合蛋白及結(jié)合特異性進(jìn)行了系統(tǒng)分析和快速篩選，為后續(xù)究節(jié)省了大量的時間，極大地減輕了相關(guān)科研工作者們的勞動強(qiáng)度。

圖 1.4 免標(biāo)記共振瑞利散射適體傳感器示意圖[34]。ure 1.4 Schematic illustration of the design principle of the label-free RRS aptase傳感檢測技術(shù)的研究進(jìn)展 電化學(xué)檢測技術(shù)

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