【摘要】：納米孔單分子傳感器相比其他傳統(tǒng)單分子檢測技術(shù)而言具有低成本高通量的優(yōu)勢。當一個帶電生物分子在外加電場力的作用下電泳穿過納米孔時,由于其物理占位作用及其與納米孔壁間的強相互作用使得過孔電流被調(diào)制,通過對調(diào)制電流的分析可以獲取待測分子的帶電特性,形狀以及取向性等特征。因此,納米孔被廣泛應(yīng)用于一些單分子的檢測中,如核酸分子,蛋白質(zhì),核酸與蛋白的結(jié)合物等,甚至用于單個DNA堿基以及蛋白質(zhì)氨基酸的識別。然而,因為核酸分子及蛋白質(zhì)分子的帶電狀態(tài),取向性以及二級結(jié)構(gòu)等都會產(chǎn)生不同的調(diào)制電流,使得實現(xiàn)高精度的核酸分子以及蛋白質(zhì)分子檢測具有極大的挑戰(zhàn)性。為了豐富納米孔單分子檢測領(lǐng)域的基礎(chǔ)理論研究,為將來實現(xiàn)高精度的納米孔單分子檢測傳感器的設(shè)計與制造提供數(shù)據(jù)支撐,本學(xué)位論文主要聚焦于研究納米孔對核酸分子及蛋白質(zhì)分子的檢測和離子電流阻塞機理的研究。本文主要研究了 DNA電泳穿過固態(tài)納米孔及生物納米孔的動力學(xué)行為過程;采用原子力顯微鏡對納米孔接入電阻進行了系統(tǒng)的研究,并成功的實現(xiàn)了對DNA過孔的降速以及高精度操控;最后用納米孔對蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài),折疊-解折疊轉(zhuǎn)變甚至蛋白質(zhì)折疊中間態(tài)進行了實時檢測。本文的主要研究內(nèi)容和結(jié)論如下:采用了分子動力學(xué)模擬的方法研究了雙鏈DNA分子以及單鏈DNA均聚物電泳穿過石墨烯納米孔的動力學(xué)過程。研究發(fā)現(xiàn)雙鏈DNA穿過石墨烯納米孔的過孔速度可以通過調(diào)節(jié)外加電壓和納米孔的尺寸來進行有效調(diào)節(jié)。較低的外加電壓使得作用在DNA上的電場力也隨之降低,因此可以降低DNA的過孔速度。當DNA穿過較大納米孔時,其過孔時間也會相應(yīng)增加,這是由于較大納米孔兩側(cè)的電勢差相比小孔而言相對較小,當DNA在孔內(nèi)時,作用在DNA上的電場力也相對較小。此外,通過分子動力學(xué)模擬進一步研究了 2 nm石墨烯納米孔對由10個堿基組成的單鏈DNA均聚物的檢測。由于四種堿基的電荷量及尺寸差異較小,在噪聲的影響下從單純的離子電流堵塞幅值上并不能區(qū)分出不同的單鏈DNA均聚物。然而,通過檢測分析poly(dA)10,poly(dC)10,poly(dG)1o和poly(dT)10的過孔時間卻能對四種單鏈DNA均聚物進行區(qū)分�；谏鲜隼碚撗芯�,納米孔的尺寸可以影響DNA的過孔速度,為了驗證這一理論結(jié)果,本文用實驗的方法研究了氮化硅納米孔尺寸對poly(dT)30過孔速度的影響。研究表明,當將納米孔的直徑從4.8 nm增加到10.8 nm的時候,poly(dT)30穿過氮化硅納米孔的速度可以降低至少一半。這一結(jié)果和上述的分子動力學(xué)仿真結(jié)果相吻合。此外,poly(dT)30過孔產(chǎn)生的阻塞電流幅值隨著納米孔直徑的增加而逐漸降低,這與采用經(jīng)典的阻塞離子電流模型得到的結(jié)果也相一致。本文研究了由胸腺嘧啶組成的柔性單鏈DNA均聚物在高濃度條件下電泳穿過α-溶血素納米孔的輸運機理。通過對阻塞電流信號分析發(fā)現(xiàn),poly(dT)20會產(chǎn)生兩種幅值的阻塞電流信號,分別由poly(dT)20的過孔以及其與α-溶血素納米孔的前庭碰撞產(chǎn)生。兩種阻塞電流的幅值分別隨著外加電壓的增加而線性增加。雖然外加電壓不同,但是相對阻塞電流幅值卻不隨著外加電壓的改變而發(fā)生變化。poly(dT)20與αα-溶血素納米孔前庭的碰撞時間也并不隨著外加電壓的變化而改變。然而poly(dT)20的過孔速度卻隨著外加電壓的增加而逐漸降低;這主要是由于胸腺嘧啶的堿基堆疊效應(yīng)較差,當外加電壓升高后,作用在poly(dT)20的作用力提高,使得其非常容易發(fā)生團簇,使過孔時間延長,分子動力學(xué)模擬結(jié)果進一步證實了這一實驗現(xiàn)象。離子電流阻塞機理是設(shè)計和指導(dǎo)納米孔單分子傳感器的重要基礎(chǔ),本文通過將納米孔單分子傳感器和原子力顯微鏡進行集成,研究了當一個物體放置在納米孔附近區(qū)域時對納米孔電阻產(chǎn)生的影響。研究結(jié)果表明在納米孔周圍存在一個半球區(qū)域,在區(qū)域內(nèi)原子力顯微鏡探針會阻塞部分離子電流,而當探針處于半球區(qū)域外時,離子電流不受探針的影響。探針在越靠近納米孔的位置其阻塞電流幅值也就越大。研究還發(fā)現(xiàn)納米孔周圍半球區(qū)域的半徑稍低于離子的捕獲半徑,而且其半徑值隨著外加電壓的增加而線性增加,隨著孔徑的增加而呈現(xiàn)出拋物線增長。值得注意的是這一半徑值與探針的工作模式以及掃描速度無關(guān)。此外,基于實驗數(shù)據(jù)的分析本文提出了一套完善的理論模型對阻塞物體距離納米孔的位置以及其幾何形狀對離子電流的影響進行了精確描述,有限元分析的方法進一步驗證了本文所提模型的正確性。DNA過孔速度過快一直是實現(xiàn)DNA測序傳感器設(shè)計與制造的一大障礙,為了解決這一難題,本文設(shè)計了一套集成了納米孔和原子力顯微鏡的且具有納米精度的操控系統(tǒng)來降低DNA穿過固態(tài)納米孔的速度甚至實現(xiàn)對DNA運動方向的控制。通過巰基-金或者生物素-鏈霉親和素的強相互作用將DNA綁定在AFM探針針尖上,結(jié)合AFM高精度的進給系統(tǒng)操控探針精確移動,可以將DNA的過孔速度降低至2 A/ms;因為目前現(xiàn)有的離子電流信號檢測頻率可達5 MHz,這一速度可以保證有足夠多的采樣點來提取待測分子的結(jié)構(gòu)信息。本套測試系統(tǒng)的另外一個優(yōu)勢是可以控制DNA的運動方向,只要DNA不從探針尖端剝落便可以一直反復(fù)實驗,對DNA阻塞電流進行反復(fù)測量降低測量誤差。蛋白質(zhì)折疊與解折疊直接關(guān)系到蛋白質(zhì)的折疊路徑,而對蛋白質(zhì)折疊路徑的探索一直是制藥領(lǐng)域難以攻克的挑戰(zhàn)。盡管傳統(tǒng)單分子檢測方法可以檢測蛋白質(zhì)的折疊過程,但是其目前缺乏高通量而且需要復(fù)雜的化學(xué)修飾。本文采用分子動力學(xué)模擬的方法從理論上說明納米孔檢測技術(shù)可以用于檢測區(qū)分蛋白質(zhì)的折疊程度。分子動力學(xué)模擬結(jié)果表明,蛋白質(zhì)的解折疊態(tài)相比其折疊態(tài)會阻塞更多的離子電流,這主要是由于離子遷移率在近蛋白質(zhì)表面發(fā)生驟降引起的。本文還基于分子動力學(xué)模擬的結(jié)果提出了一套具有原子精度的理論模型用于計算蛋白質(zhì)不同折疊態(tài)的阻塞電流,理論計算結(jié)果表明,蛋白質(zhì)折疊態(tài)和解折疊態(tài)產(chǎn)生的阻塞電流在考慮蛋白質(zhì)取向性以及構(gòu)象性變化的情況下依然能被區(qū)分開來,通過對一系列蛋白質(zhì)折疊動力學(xué)軌跡的分析進一步證實了納米孔離子電流的測量可以實時檢測蛋白質(zhì)折疊態(tài)與解折疊態(tài)的轉(zhuǎn)變過程,甚至可以識別出蛋白質(zhì)折疊中間態(tài)。
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【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：TB383.1;O629.73

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 SI Wei;YANG HaoJie;LI Kun;WU GenSheng;ZHANG Yin;KAN YaJing;XIE Xiao;SHA JingJie;LIU Lei;CHEN YunFei;;Investigation on the interaction length and access resistance of a nanopore with an atomic force microscopy[J];Science China(Technological Sciences);2017年04期

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本文編號：2629555