本文選題：診斷治療學　切入點：核酸適體　出處：《湖南大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：診斷治療學是一種將治療學與診斷學結(jié)合起來的新興治療策略,同時也被醫(yī)學界視為未來眾多疾病療程的主流,有望為個體化醫(yī)學的實現(xiàn)起到極大的推動作用。設(shè)計與合成高靶向、高靈敏、高療效、高穩(wěn)定和低毒副作用的“診療一體化”多功能探針則是診斷治療學技術(shù)發(fā)展和應用中的重中之重。近年來,伴隨著納米技術(shù)的出現(xiàn)和快速發(fā)展,一系列具有特殊物理化學性質(zhì)的功能化納米材料被不斷開發(fā)出來,為“診療一體化”多功能探針的構(gòu)建提供了新的契機。同時,作為化學“抗體”,核酸適體則因分子量小、免疫原性低、易化學合成與標記等諸多優(yōu)勢而在腫瘤診斷與治療領(lǐng)域中獲得了重要關(guān)注,特別是在用于活體等復雜體系時,核酸適體往往表現(xiàn)出血液和非靶器官中滯留時間短、組織內(nèi)滲透和攝取速度快以及靶組織聚集率高等特點,為發(fā)展具有在復雜體系中高效靶向能力的“診療一體化”多功能探針提供了一種理想的分子識別元件。因此,本論文瞄準構(gòu)建與發(fā)展新型“診療一體化”多功能探針這一前沿研究熱點,擬以合成新型的復合金屬納米熱療材料為前提目標,同時結(jié)合Aptamer(核酸適體)作為靶向識別探針的優(yōu)勢,設(shè)計和構(gòu)建多種新型腫瘤診療探針。具體包括以下幾方面的工作:一、Au@Ag-Au納米顆粒的合成及其腫瘤光熱治療應用研究金納米棒,因其優(yōu)異的性能,包括易合成、靈活標記、在近紅外區(qū)域具有可調(diào)的吸收波譜以及大的消光系數(shù)而被廣泛地應用于體內(nèi)外腫瘤選擇性光熱治療。然而,合成過程中模板劑CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)本身所帶來的細胞毒性以及金納米棒相對薄弱的近紅外吸收可能限制其在生物醫(yī)學領(lǐng)域中的進一步應用。為此,本文采用在金納米棒外面包被銀/金合金的方式,發(fā)展了一種形狀可控波譜可調(diào)的方法用于Au@Ag-Au納米顆粒的合成。電鏡和紫外可見波譜分析表明,納米顆粒的形狀和大小由金納米棒外包被銀層的厚度決定,而銀/金合金納米殼的存在則能有效提高復合納米顆粒的近紅外吸收。通過條件優(yōu)化,最終獲得的Au@Ag-Au納米球(Au@Ag-Au NSs)大小約為40 nm,吸收波譜分布寬且強(400-1100 nm),而且毒性較低;與金納米棒相比,Au@Ag-Au NSs的熱療效果增強了4.7倍左右。隨后以人肺腺癌細胞A549為模型,對Au@Ag-Au NSs的細胞殺傷性能進行了一系列的表征。結(jié)果表明,在980 nm激光照射下,Au@Ag-Au NSs能有效地殺傷腫瘤細胞,通過進一步提高顆粒濃度,延長孵育或者是光照時間細胞的光熱殺傷效果明顯增強。此外,初步的活體研究表明,注射有Au@Ag-Au NSs的腫瘤在施以激光照射后產(chǎn)生了明顯的壞死現(xiàn)象。由此可見,Au@Ag-Au NSs作為一種高效而有發(fā)展前景的近紅外光熱治療試劑,在生物醫(yī)學研究領(lǐng)域中顯示出極大的應用潛力。二、基于核酸適體功能化au@ag-au球形納米顆粒的激活式腫瘤成像及其引導下的光熱治療研究目前,基于納米材料所構(gòu)建的診療探針越來越受到人們的關(guān)注并在腫瘤治療中顯示出極大的應用前景。然而,對于同時具有高特異性、高成像對比度及治療功效的多功能診療納米探針的開發(fā)仍然存在著很大的挑戰(zhàn)。基于此,本文通過將激活式aptamer探針(aap)組裝到具有在近紅外區(qū)高光熱轉(zhuǎn)換效率的au@ag-aunss上,成功構(gòu)建新型激活式診療納米探針(atnp)。其中,au@ag-aunss作為淬滅劑同時也充當產(chǎn)熱試劑,不僅展現(xiàn)出良好的熒光淬滅性能,而且,與金納米棒相比,近紅外區(qū)的產(chǎn)熱效率更高;aap探針則是由一條具有腫瘤細胞特異性識別能力的巰基化aptamer和與該aptamer部分序列互補的標有熒光基團的短鏈dna(cdna)組成。當體系中沒有靶標存在時,aap探針保持著穩(wěn)定的雙鏈構(gòu)型,cdna所帶熒光分子與au@ag-aunss表面靠近,導致熒光信號處于淬滅狀態(tài);而當加入靶腫瘤細胞后,由于aptamer與細胞膜上的靶標結(jié)合并形成特定構(gòu)型,從而在將au@ag-aunss帶至細胞表面的同時也破壞了aap探針的雙鏈結(jié)構(gòu),使得cdna遠離顆粒表面,熒光信號得到激活而升高。通過監(jiān)測該體系中的熒光信號變化情況可指示靶腫瘤細胞的位置所在,且根據(jù)上述熒光激活信號的引導,在清楚了解病灶位置和類型的基礎(chǔ)上,可有效實施定點、按需的近紅外光熱治療。隨后,以人肺腺癌細胞a549作為腫瘤模型,系統(tǒng)考察了atnp在體內(nèi)外的成像及治療行為。結(jié)果表明,atnp確實能大大地提高腫瘤成像對比度,同時完成特異性的腫瘤光熱殺傷,在將來有望作為一種強有力的、通用的診療策略用于個體化醫(yī)學。三、基于核酸適體功能化cu-au納米顆粒診療探針的腫瘤活體熒光成像與光熱治療研究作為腫瘤診療中的常用材料,具有光響應性能的金納米材料依然存在著一些不足,比如導熱系數(shù)低,激光誘導的熔化效應以及成本較高等�；诖�,本文采用一種簡便、溫和、一鍋煮的合成方法,通過引入成本低、導熱性更高的銅元素,制備了一種新型的cu-au合金納米結(jié)構(gòu)(cu-auns)。通過結(jié)合cu和au各自的優(yōu)點,所制備的cu-aunss呈現(xiàn)出寬而強的近紅外吸收帶;與金納米棒相比,cu-aunss在激光照射下展現(xiàn)出更高的產(chǎn)熱效率以及光穩(wěn)定性。隨后,通過將標有熒光基團的aptamer(f-apt)修飾到cu-aunss上以構(gòu)建基于f-apt包被cu-aunss的診療平臺(cu-au@f-aptnss)。隨即選擇人白血病細胞ccrf-cem及其aptamercy5-sgc8c為模型,成功實現(xiàn)了cu-au@cy5-sgc8cnss對體外腫瘤細胞以及體內(nèi)腫瘤組織的選擇性熒光成像與近紅外光熱治療。綜上所述,基于cu-au@f-aptnss的診療平臺具有構(gòu)建簡便、穩(wěn)定、生物相容性好和高效等優(yōu)點,有望作為一種通用的工具用于腫瘤診療。四、基于碘響應性Cu-Au納米顆粒的腫瘤細胞高靈敏比色檢測研究比色法,因其具有可視化、簡單、快速、成本低、不需要昂貴儀器等優(yōu)點,而成為一種非常有發(fā)展?jié)摿Φ哪[瘤細胞檢測方法。然而,目前所報道的方法大都存在著靈敏度低、探針合成或設(shè)計復雜等缺陷�；诖�,本文巧妙地選取了具有碘特異性響應性能的Cu-Au納米顆粒(Cu-Au NP)作為有效橋梁,利用其對碘的化學吸收作用和易于生物修飾性能,將碘催化H2O2-TMB顯色體系與分子識別探針進行定量相關(guān),建立了一種具有通用性的新型比色分析技術(shù)平臺。在此基礎(chǔ)上,進一步選擇人白血病細胞CCRF-CEM作為模式生物靶標,利用Aptamer Sgc8c修飾的Cu-Au NPs(Sgc8c-Cu-Au NPs)作為探針對其進行檢測分析。結(jié)果表明,基于Sgc8c-Cu-Au NPs可成功實現(xiàn)簡便、免標記、低耗、可視、高選擇性和高靈敏的靶細胞分析。此外,該方法還適用于復雜的血清樣品分析。因此,本文所發(fā)展的方法不僅能極大地拓展碘催化顯色體系的應用領(lǐng)域,而且將為發(fā)展簡便、快速、靈敏和特異的癌細胞比色分析方法提供一種全新的思路。五、具有高催化活性和強等離子體共振特性的Cu-Au-Pt納米顆粒合成與腫瘤診療應用研究雙金屬或者是多元素金屬納米顆粒,由于協(xié)同效應被賦予新的、增強的性能而越來越受到研究人員的關(guān)注。本文發(fā)展了一種簡便、溫和、一鍋煮的方法用于合成催化活性好與產(chǎn)熱能力強的Cu-Au-Pt復合納米顆粒(Cu-Au-Pt NPs)。通過在Cu-Au-Pt NPs表面修飾上具有靶向功能的Aptamer探針,成功構(gòu)建了一種制備簡便、免標記的診療探針。在此基礎(chǔ)上,選擇人白血病細胞CCRF-CEM作為模型,考察了所構(gòu)建探針對靶細胞的選擇性檢測能力及光熱殺傷效果。鑒于靶識別分子的多樣性,同時結(jié)合Cu-Au-Pt NPs優(yōu)越的催化及產(chǎn)熱性能,有望發(fā)展一種通用的平臺用于生物傳感及其它生物醫(yī)學研究。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：湖南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：TB383.1;R730.5

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本文編號：1649539