本文關(guān)鍵詞：月見(jiàn)草素B納米乳液體系的構(gòu)建及其控釋機(jī)理研究　出處：《華南農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：課題組的前期研究已嘗試?yán)檬称芳?jí)生物活性肽——酪蛋白磷酸肽(Casein Phosphopeptides,CPP)與活性多糖——?dú)ぞ厶?Chitosan,CS)構(gòu)建活性物載體體系,系統(tǒng)研究了兩者相互作用關(guān)系,并明確構(gòu)建條件和步驟。本研究在前期研究基礎(chǔ)上利用該載體體系包埋一種天然抗氧化、抗炎、抗腫瘤的活性大環(huán)二聚體鞣質(zhì)——月見(jiàn)草素B(Oenothein B,OeB)。由于OeB是具有酯鍵及大量羥基的大環(huán)二聚體鞣質(zhì)結(jié)構(gòu),它的加入也會(huì)影響酪蛋白磷酸肽-殼聚糖載體體系的構(gòu)建,因此,本論文從研究三者相互作用出發(fā),進(jìn)一步指導(dǎo)OeB納米載體小球的構(gòu)建條件、方式,從而實(shí)現(xiàn)OeB的有效包埋。同時(shí),優(yōu)化了適合大規(guī)模生產(chǎn)的制備方法,對(duì)制備納米小球的穩(wěn)定性、緩釋作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。最后研究了納米小球在Caco-2細(xì)胞模型中吸收機(jī)制。研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下:(1)CPP/CS/OeB相互作用研究。通過(guò)改變CPP/CS/OeB三者比例、體系濃度,觀察三者相互作用現(xiàn)象,采集粒徑(Particle Size)、光強(qiáng)(Count Rate)、多分散性系數(shù)(Polydispersity)、濁度(Turbidity)等表征參數(shù),繪制出三者相圖,總結(jié)規(guī)律。研究發(fā)現(xiàn),在只有CS和OeB的體系中,隨OeB與CS質(zhì)量比值的增大,體系經(jīng)歷溶液-溶膠-絮凝沉淀(Solution-Sol-Flocculation)轉(zhuǎn)變,但在物質(zhì)總濃度低于0.9 mg/m L時(shí),兩者相互作用現(xiàn)象不明顯。在只有CPP和CS的體系中,體系隨CPP與CS質(zhì)量比值的增大經(jīng)歷溶液-聚電解質(zhì)小球-顆粒狀沉淀(Solution-Complex Coacervate-Precipitation)轉(zhuǎn)變,該轉(zhuǎn)變過(guò)程在很小的濁度下就可以發(fā)現(xiàn);當(dāng)兩者比例不變時(shí),隨總濃度上升,參數(shù)粒徑、光強(qiáng)值、濁度均呈上升趨勢(shì)。在只有CPP和OeB的體系中,無(wú)論濃度高低,體系保持澄清透明狀態(tài)。在CPP/CS/OeB體系中,存在四種狀態(tài):(1)溶液(Solution)、(2)聚電解質(zhì)小球(Complex Coacervate)、(3)絮凝沉淀(Flocculation)、(4)顆粒狀沉淀(Precipitation)。以四種狀態(tài)為區(qū)域劃分依據(jù),在三角形坐標(biāo)圖中,繪制CPP/CS/OeB相圖。對(duì)比CPP/CS/OeB相圖發(fā)現(xiàn),影響CPP/CS/OeB狀態(tài)的主要因素為三者比例,濃度次之。以相圖作為指導(dǎo),從CPP/OeB/CS共同作用所形成聚合物的粒徑、數(shù)量、體系穩(wěn)定性等方面綜合考慮,選擇體系終濃度為1.4mg/m L,CPP/CS/OeB三者比例為3:3:1的條件制備聚電解質(zhì)納米小球,此時(shí)納米小球粒徑為156.1±2.2 nm,帶電量22.02±1.3 m V,光強(qiáng)652.1±kcps、多分散性系數(shù)0.214。(2)OeB納米小球制備工藝的優(yōu)化。工藝流程為交聯(lián)、離心、超聲、真空冷凍干燥四個(gè)步驟。首先,本實(shí)驗(yàn)以粒徑、光強(qiáng)、包封率、載藥量為指標(biāo),研究了天然交聯(lián)劑京尼平的添加量、作用時(shí)間對(duì)京尼平交聯(lián)的OeB納米小球(OeB-GNP)的固化效果的影響;其次,以上清液和納米小球富集液的粒徑、光強(qiáng)為指標(biāo),研究了離心力、離心時(shí)間對(duì)其分離、富集效果的影響;再者,以分析多分散性系數(shù)、粒徑、光強(qiáng)、濁度為指標(biāo),研究了超聲功率、超聲時(shí)間對(duì)OeB-GNP的分散效果的影響;最后,以粒徑及其分布為指標(biāo),利用掃描電鏡圖,研究真空冷凍干燥工藝對(duì)OeB-GNP形狀的影響。結(jié)果表明,OeB-GNP的最佳工藝為:京尼平體系濃度為0.4 mg/m L,交聯(lián)時(shí)間12h;離心條件為13400g,30min;超聲條件為100W,45min。工藝優(yōu)化后所得OeB-GNP參數(shù)為:粒徑范圍170~290 nm,Count Rate范圍為500~700 kcps,帶電量18.06±1.8 m V,多擴(kuò)散系數(shù)0.200±0.05,OeB包封率為99%,載藥量為15%。(3)OeB-GNP控釋效果及穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。以O(shè)eB的保留率和納米小球中OeB釋放率為指標(biāo),研究p H、溫度、時(shí)間、人工模擬胃腸液、消化酶液環(huán)境的變化對(duì)OeB穩(wěn)定性和OeB-GNP控釋效果的影響;其次,以粒徑、光強(qiáng)、多分散性系數(shù)、濁度為指標(biāo),研究了p H、溫度、貯存時(shí)間、溶液環(huán)境的變化對(duì)納米小球性狀的影響;最后,以熒光值為指標(biāo),使用多功能酶標(biāo)儀和熒光倒置顯微鏡分析OeB-GNP清除活性的能力。結(jié)果表明,在p H 1.2~7.0、溫度4~25℃條件下以及不同溶液環(huán)境中交聯(lián)納米小球性狀穩(wěn)定。在人工模擬胃腸液和兩種消化酶液中,交聯(lián)納米小球中OeB釋放率隨時(shí)間的變化而不同,均在10%以內(nèi),其中,在人工模擬胃液中釋放率最低,為0.2%~0.6%,在人工模擬胃液中釋放率最高,為0.4%~9.6%,被包埋的OeB得以緩釋和保護(hù),相反,空白對(duì)照未包埋的OeB穩(wěn)定性差。細(xì)胞抗氧化能力研究方面顯示,OeB-GNP具有一定的抗氧化活性,并呈現(xiàn)良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系,但效果不如未包埋的OeB。當(dāng)CAA值達(dá)到50時(shí),OeB-GNP中OeB的質(zhì)量濃度為0.117 mg/m L,而未包埋的OeB質(zhì)量濃度為0.024 mg/m L。(4)OeB-GNP吸收效果的評(píng)價(jià)。本文成功地建立Caco-2細(xì)胞模型,并考察OeB-GNP在Caco-2單層細(xì)胞的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)特征,評(píng)價(jià)其在腸道的吸收效果。利用倒置熒光顯微鏡觀Caco-2細(xì)胞攝取效果,發(fā)現(xiàn)OeB-GNP能很好地附著在Caco-2細(xì)胞表面。利用采用高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)OeB和OeB-GNP轉(zhuǎn)運(yùn)后BL側(cè)OeB的轉(zhuǎn)運(yùn)量,均未能檢測(cè)到OeB。但利用動(dòng)態(tài)光散射法檢測(cè)OeB-GNP轉(zhuǎn)運(yùn)后BL側(cè)的表征參數(shù),發(fā)現(xiàn)隨轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間的延長(zhǎng)和轉(zhuǎn)運(yùn)濃度的增大,BL側(cè)樣液的Count Rate值增大,粒徑分布主要范圍在80~105 nm,表明OeB-GNP能以整體形式透過(guò)細(xì)胞模型。
[Abstract]:In this study , we have attempted to construct an active carrier system with bioactive peptide ( CPP ) and active polysaccharide _ chitosan ( CS ) using food - grade bioactive peptide ( CPP ) and active polysaccharide _ chitosan ( CS ) . In the system of CPP and OeB , the interaction between OeB and CS / OeB was studied . According to CPP / CS / OeB phase diagram , the particle size , quantity and system stability of CPP / CS / OeB were studied . The results showed that the particle size of the nano - pellets was 156.1 鹵 2.2 nm , the charge quantity was 22.02 鹵 1.3 m V , the light intensity was 652.1 鹵 kcps , and polydispersity index was 0.214 . The effects of ultrasonic power and ultrasonic time on the dispersion of OeB - GNP were studied by means of SEM and SEM . The drug loading is 15 % . The effect of OeB - GNP on the stability of OeB and OeB - GNP was studied . It was found that OeB - GNP could be well attached to Caco - 2 cell surface by using reversed fluorescence microscope ( HPLC ) .

【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：TS201.2;TB383.1
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本文編號(hào)：1380198