【摘要】：副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)是非常重要的人獸共患病原菌之一,主要來(lái)源于海水及海產(chǎn)品中。該菌常引起腹瀉、惡心、發(fā)熱等典型的胃腸炎型癥狀,關(guān)于其致病機(jī)制尚未完全闡明,耐熱直接溶血素(TDH)、耐熱相關(guān)溶血素(TRH)是目前公認(rèn)的副溶血性弧菌主要毒力因子。近年來(lái),養(yǎng)殖業(yè)及臨床上抗生素的不規(guī)范使用也導(dǎo)致副溶血性弧菌的耐藥性日趨嚴(yán)重,對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,而且國(guó)內(nèi)外缺乏耐藥性流行病學(xué)連續(xù)性監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù),在耐藥機(jī)制方面的研究也較少。本研究對(duì)107株不同來(lái)源的副溶血性弧菌毒力基因分布、耐藥性進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查,并通過(guò)體外梯度誘導(dǎo)建立耐藥株模型,經(jīng)突變分析研究喹諾酮耐藥機(jī)制。具體研究方法和結(jié)果如下:(1)利用VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)107株分離株完成菌株鑒定,通過(guò)PCR擴(kuò)增進(jìn)行毒力基因的篩查,其中tlh基因在所有分離株中均有檢出,tdh、trh陽(yáng)性率分別為18.7%(20/107)、8.4%(9/107),orf8攜帶率介于兩者之間,為15%(16/107),且orf8+株全部表現(xiàn)為tdh+,且臨床分離株的毒力基因陽(yáng)性率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于環(huán)境分離株。通過(guò)設(shè)計(jì)引物對(duì)107株分離株VPA0166(編碼推測(cè)外膜蛋白基因)進(jìn)行PCR檢測(cè),發(fā)現(xiàn)有55株是a型(996bp)陽(yáng)性,52株是b型(1050bp)陽(yáng)性。經(jīng)測(cè)序比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)a型產(chǎn)物中在523至580bp之間有54個(gè)堿基缺失,b型序列與已發(fā)表基因組序列的副溶血性弧菌RIMD 2210633上的相應(yīng)序列同源性達(dá)99%,說(shuō)明b型菌株在進(jìn)化過(guò)程中與測(cè)序菌株更接近。此外,VPA0166多樣性與tdh和trh基因的攜帶具有相關(guān)性,全部tdh+菌株屬于b型,而trh+菌株均屬于a型。(2)藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,僅有對(duì)頭孢西丁、四環(huán)素和復(fù)方新諾明的耐藥株檢出,對(duì)頭孢西丁的耐藥率為1.9%(2/107),有一株對(duì)四環(huán)素和復(fù)方新諾明同時(shí)完全耐藥(基因型為tdh-trh-orf8-),對(duì)頭孢西丁和環(huán)丙沙星的中敏感率較高,分別達(dá)94.4%(101/107)、44.9%(48/107)。其中tdh+trh-/tdh-trh+型菌株對(duì)環(huán)丙沙星的中敏感率(51.7%)比tdh-trh-型菌株(41.9%)占比高約10個(gè)百分點(diǎn),推測(cè)在抗生素選擇壓力下潛在致病性副溶血性弧菌比不帶毒菌株有更好耐受能力。此外,統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)在VPA0166 a型、b型菌群對(duì)環(huán)丙沙星中介敏感率分別為23.6%、67.3%,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),表明b型菌株對(duì)環(huán)丙沙星更趨于耐藥,在長(zhǎng)期抗生素作用下更有可能發(fā)展為優(yōu)勢(shì)菌群。(3)以耐藥性、VPA0166基因型為參考,選擇40個(gè)分離株利用PCR方法擴(kuò)增染色體介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因,發(fā)現(xiàn)parE基因75位的突變與低水平耐藥有關(guān),多藥外排泵NorM的96位和117位是與環(huán)丙沙星耐藥機(jī)制相關(guān)的突變點(diǎn)。此外,對(duì)全部分離株進(jìn)行質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因(PMQR)檢測(cè),共檢出10株P(guān)MQR陽(yáng)性菌株,陽(yáng)性率為9.3%(10/107),其中 qnrC、qnrS、qnrVC基因陽(yáng)性率分別為 5.6%(6/107)、0.9%(1/107)、2.8%(3/107),且都存在堿基突變。通過(guò)在環(huán)丙沙星梯度培養(yǎng)基中連續(xù)傳代篩選,建立穩(wěn)定可靠的耐藥株模型,其最低抑菌濃度MIC升高了 64～128倍。在對(duì)喹諾酮決定區(qū)(QRDR)基因和主動(dòng)外排泵檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)gyrB、parE均未發(fā)生突變,gyrA基因的第83位點(diǎn)Ser→Ile突變頻率最高,廣泛存在于高度耐藥株中,是作用的主要靶位基因,當(dāng)環(huán)丙沙星MIC為16 μg/mL時(shí)核苷酸第369位存在ACC→ACA的突變,而對(duì)應(yīng)氨基酸未發(fā)生改變。菌株VP1276R存在gyrA基因第83位突變的同時(shí),還在parC基因第85位有Ser→Phe突變。從誘導(dǎo)結(jié)果可以看出存在gyrA和parC基因突變的都為VPA0166 b型菌株,推測(cè)VPA0166 b型菌株在藥物脅迫作用下更容易發(fā)生相關(guān)耐藥基因突變,從而引起耐藥性的產(chǎn)生。
【圖文】：

用接種環(huán)無(wú)菌沾�。常�°Ｃ搖床培養(yǎng)后的新鮮培養(yǎng)物劃線于ＴＣＢＳ瓊脂平板，３７°Ｃ培養(yǎng)逡逑２４邋ｈ。典型的副溶血性弧菌在ＴＣＢＳ上呈圓形、半透明、表面光滑的綠色菌落，用接種環(huán)逡逑輕觸，有類似口香糖的質(zhì)感，直徑２邋ｍｍ－３邋ｍｍ。如圖２－１所示，，１０７株分離株在ＴＣＢＳ瓊逡逑脂平板上均有此種形態(tài)。逡逑柋逡逑圖２－１副溶血性弧菌分離株在ＴＣＢＳ培養(yǎng)基上的形態(tài)逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ邋ｉｓｏｌａｔｅｓ邋ｏｎ邋ＴＣＢＳ邋ａｇａｒ逡逑２．２菌株鑒定結(jié)果逡逑ＶＩＴＥＫ－２邋Ｃｏｍｐａｃｔ全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)ＧＮ鑒定卡檢測(cè)過(guò)程大約９邋ｈ可以完成，逡逑鑒定結(jié)果顯示１０７株分離株均為副溶血性弧菌，如表２－４所示�？梢钥闯�，副溶血性弧菌逡逑主要生化性狀如ＳＡＣ邋（蔗糖）、ｄＭＡＮ邋（Ｄ－甘露醇）、ｄＭＮＥ邋（Ｄ－甘露糖）、Ｈ２Ｓ邋（產(chǎn)Ｈ２Ｓ）、逡逑ＬＤＣ邋（賴氨酸脫羧酶）等與ＧＢ邋４７８９．７－２０１３中描述相符。逡逑

ｐ邐逡逑７５０ｂｐ—ＶＰＡ０１６６－ｌ（ａ邋型）逡逑圖２－３邋ＶＰＡ０１６６－１引物擴(kuò)增結(jié)果逡逑Ｆｉｇ．２－３邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＶＰＡ０１６６邋ｇｅｎｅ邋ｏｆ邋Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ邋ｉｓｏｌａｔｅｓ邋ｕｓｉｎｇ邋ＶＰＡ０１６６－１邋ｐｒｉｍｅｒｓ逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００；邋Ｎ：邋Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ；邋１￣５：邋Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ邋ｉｓｏｌｄｉｔｔｓ逡逑然而，在瓊脂糖凝膠電泳中目的條帶大小差別并不明顯，為避免誤差，能夠更好地分逡逑析ＶＰＡ０１６６基因在不同菌株中的分布情況和差異性，通過(guò)ＮＣＢＩ數(shù)據(jù)庫(kù)Ｂｌａｓｔｅｎ查找所有逡逑同源性序列進(jìn)行對(duì)比分析，利用Ｐｒｉｍｅｒ邋５．０引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)一段擴(kuò)增產(chǎn)物大小較小的引逡逑物ＶＰＡ０１６６－２進(jìn)行擴(kuò)增，由圖２－４可以看出凝膠中目的片段位置處條帶明亮單一，且大小逡逑能夠更好地區(qū)分，經(jīng)統(tǒng)計(jì)，有５５株是ａ型陽(yáng)性，５２株是６型陽(yáng)性。逡逑Ｍ邋Ｎ邋１邋２邐３邐４邐５邋６邐７邐８邐９邋１０邋１１邋１２邋１３邋１４逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：TQ460.1


本文編號(hào)：2641737