【摘要】：研究背景：隨著經(jīng)濟的發(fā)展,生活水平的提高、環(huán)境和習慣的改變,我國乃至全球肥胖癥患病人數(shù)逐漸增多,1980年以來,世界肥胖人數(shù)增長了近一倍,至2008年,20歲及以上的成年人中有超過14億人超重,其中2億多男性和近3億女性為肥胖癥患者,肥胖正威脅著越來越多的人的健康：超重和肥胖是全球引起死亡的第六大風險,許多疾病都與肥胖有著密切的關系：如糖尿病、高脂血癥、高血壓病、冠心病及某些腫瘤如乳腺癌、直腸癌等。肥胖及其所帶來的健康問題為全球各個國家的經(jīng)濟增加了沉重的負擔。在成人,肥胖的病理生理主要是指脂肪細胞體積的增大,即細胞內甘油三酯含量的增加,其原因包括甘油三酯合成的增加和/或者分解的減少。在本研究中,我們重點關注了脂肪細胞內甘油三酯的分解代謝(即脂解)。脂解是指甘油三酯逐步分解為游離脂肪酸和甘油的過程,這一過程受很多酶和因子的調控。曾經(jīng),人們認為激素敏感性脂肪酶(HSL)是甘油三酯分解過程中的唯一限速酶,直到脂肪甘油三酯脂酶(Adipose Triglyceride Lipase, ATGL)被人們發(fā)現(xiàn)。ATGL于2004年被發(fā)現(xiàn),隨后的研究發(fā)現(xiàn),它是脂解過程中的一種重要的限速酶：ATGL負責將甘油三酯分解為甘油二酯和游離脂肪酸,啟動了甘油三酯的分解過程。研究發(fā)現(xiàn),ATGL在甘油三酯分解代謝的基礎脂解以及腎上腺素等刺激后引起的脂解過程中可能都發(fā)揮著重要的作用,ATGL是脂解過程中的重要的限速酶。ATGL基因敲除后,小鼠出現(xiàn)多器官中甘油三酯堆積、以致嚴重影響了其心臟功能、引起小鼠早期死亡；在人體,ATGL基因突變后也可以引起器官中中性脂肪的堆積。亞臨床甲狀腺功能減退癥(subclinical hypothyroidism, SCH),即我們簡稱的亞甲減,是指血液中促甲狀腺激素(TSH)的水平高于正常、而游離甲狀腺素即游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、血清游離甲狀腺素(FT4)水平在正常參考值范圍內,它可能是甲狀腺功能減退的早期階段。臨床資料顯示：亞臨床甲狀腺功能減退與高脂血癥、肥胖等相關,TSH與體重正相關,這說明TSH可能參與調節(jié)體內的脂肪代謝。TSH是體內調控甲狀腺功能的重要的蛋白分子,它由腺垂體分泌,在體內與促甲狀腺激素受體(TSHR)結合后發(fā)揮其生理作用。近年來的研究證明,TSHR也在脂肪細胞上表達、具有一定的調節(jié)脂質代謝的功能：TSH可以促進前脂肪細胞向成熟的脂肪細胞分化,另有研究稱TSH也可以促進甘油三酯分解,但目前,TSH對脂肪細胞內甘油三酯分解代謝過程中的限速酶之一的ATGL的表達有無影響尚未見報道,在本實驗中,我們試圖從體內、體外水平觀察TSH能否影響ATGL的表達及其可能的分子機制。目的：1.脂肪細胞已經(jīng)被證明可以表達功能性TSHR,本課題擬觀察Tshr-/-小鼠附睪脂肪細胞中ATGL的表達；另外在體外實驗中用TSH處理誘導分化成熟的脂肪細胞,觀察TSH對ATGL表達的影響,通過體內實驗及體外實驗來探討TSH在脂解過程中可能發(fā)揮的作用,揭示亞臨床甲減致肥胖的可能分子機制。2、利用cAMP激動劑forskolin和PKA抑制劑H89及TSH分別處理誘導分化成熟的脂肪細胞,觀察細胞中ATGL的表達,以此來觀察cAMP/PKA通路是否參與了TSH對ATGL的作用、揭示其可能的作用機制。研究方法：1、細胞培養(yǎng)：按照培養(yǎng)方案將3T3-L1小鼠成纖維細胞通過誘導分化、培養(yǎng)成為成熟的脂肪細胞,在將細胞進行誘導分化的過程中,分別觀察不同天數(shù)時細胞中ATGL的表達。并用0.1 u M、1 u M、2 μ M的bTSH分別處理分化成熟的脂肪細胞24小時及48小時,然后觀察細胞中ATGL表達的變化。2、動物模型：Tshr-/-小鼠及Tshr+/+/小鼠飼養(yǎng)于屏障(SPF)環(huán)境中,按照白天與夜晚各12小時予以晝夜循環(huán),飼料和水自由攝入。4-6周斷乳后對雄性小鼠進行基因型鑒定,按照基因型鑒定結果將同窩雄性小鼠分為三組：Tshr+/+、Tshr+/-和Tshr-/-, Tshr-/-組小鼠予以外源性補充T4；Tshr-/-小鼠和Tshr+/+小鼠用于實驗。3、利用油紅0染色觀察脂肪細胞內脂滴的情況。4、采用RT-PCR技術檢測細胞中ATGL基因mRNA的表達。5、采用Western Blotting方法檢測細胞中ATGL蛋白的表達。6、采用免疫熒光方法觀察ATGL在脂肪細胞中的表達和分布。7、采用免疫組化方法觀察ATGL在脂肪組織細胞中的表達及分布。8、采用SAS系統(tǒng)和SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù)。計量資料采用x±s做描述,多組均數(shù)比較采用方差分析,方差不齊的采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。結果：1小鼠Tshr基因敲除后附睪周圍脂肪細胞內ATGL的表達明顯增加我們應用免疫組化技術,觀察了Tshr-/-小鼠和Tshr+/+小鼠附睪周圍脂肪組織石蠟切片中脂肪細胞內ATGL的分布和表達。免疫組化結果顯示：在小鼠附睪周圍脂肪組織石蠟切片中,脂肪細胞中的脂滴呈空泡狀,細胞核被脂滴擠到一邊,緊貼細胞膜,ATGL呈棕黃色,分布于細胞質中,亦被脂滴擠到一邊、緊貼細胞膜；與Tshr+/+小鼠相比,Tshr-/-小鼠脂肪組織石蠟切片中,脂肪細胞中ATGL表達增多。同時,我們用Western blotting方法和RT-PCR方法分貝檢測了附睪脂肪組織中ATGL蛋白的表達和mRNA的表達。與Tshr+/+小鼠相比,Tsh-/-小鼠附睪脂肪細胞中ATGL的蛋白表達及RNA表達都明顯增加,這些都提示TSH可能抑制脂肪細胞中ATGL的表達。2.TSH抑制成熟3T3-L1細胞中ATGL的表達2.1在3T3-L1細胞被誘導分化的過程中,細胞中的ATGL的蛋白表達逐漸增加。在3T3-L1前脂肪細胞中,ATGL的蛋白表達量很少,隨著誘導分化過程中天數(shù)的增加,細胞中ATGL的蛋白量逐漸增加,至D16天,80%--90%的前脂肪細胞分化為成熟的脂肪細胞,ATGL的蛋白表達量最高。2.2 TSH抑制成熟3T3-L1脂肪細胞中ATGL的表達我們分別用0.1 μM、1 μ M、2μ M bTSH處理成熟脂肪細胞24小時和48小時,發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比,bTSH刺激后成熟脂肪細胞內ATGL表達明顯減少：處理24小時后,0.1 μM、1 μM與2 μMbTSH處理組與對照組相比,細胞內ATGL蛋白含量分別減少了31.1%(p0.01)、57.3%(p0.01)和58.1%(p0.01)；處理48小時后,0.1μ M、1μ M與2μ MbTSH處理組與對照組相比,細胞內ATGL蛋白含量分別減少了45.1%(p0.01)、60.5%(p0.01)和77.1%(p0.01),差異均有統(tǒng)計學意義。bTSH對ATGL的這種抑制作用呈明顯的劑量依賴性,尤其在細胞被bTSH處理48小時后,不同劑量組間的差異顯著(皆p0.01)。但bTSH對ATGL的抑制作用在0.1μM和1 μM時并沒有表現(xiàn)出顯著的時間依賴性：0.1μM bTSH分別處理細胞24小時和48小時后,細胞內的ATGL的蛋白表達均減少,但兩組ATGL減少的量之間的差異并不顯著；同樣,應用1 μMbTSH分別處理細胞24小時和48小時后,兩組細胞內的ATGL的蛋白表達均減少,但兩組ATGL減少的量之間的差異也并不顯著。但是應用2μM bTSH分別處理細胞48小時后,細胞內ATGL蛋白表達的減少較處理24小時后ATGL表達的減少更顯著(p0.01)。用2 μMbTSH處理成熟脂肪細胞48小時后,應用RT-PCR技術觀察細胞中ATGL的mRNA含量變化,結果發(fā)現(xiàn)細胞中ATGL的mRNA的含量較空白對照組減少約70%,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.01)。以上結果顯示,bTSH可以抑制成熟脂肪細胞中ATGL的表達,這種作用呈劑量依賴性。3 TSH通過激活cAMP/PKA途徑抑制ATGL的表達3.1 cAMP激動劑forskolin可以抑制成熟3T3-L1細胞中ATGL的表達3T3-L1細胞被誘導分化為成熟脂肪細胞后,分別用濃度為2.5uM和5uM的forskolin處理細胞24小時后,應用Western blotting方法檢測細胞中ATGL的蛋白表達,結果發(fā)現(xiàn),和對照組相比,2.5uM處理組細胞內ATGL蛋白含量減少了47%(p0.01),5uM處理組細胞內ATGL蛋白含量減少了52%(p0.01)。3.2 PKA抑制劑H89對于成熟3T3-L1細胞中ATGL的表達無明顯影響將3T3-L1細胞誘導分化為成熟脂肪細胞后,分別用濃度為5uM和10uM的H89處理細胞24小時后,應用Western blotting方法檢測細胞中ATGL的蛋白表達,結果發(fā)現(xiàn),和對照組相比,兩個處理組細胞內ATGL蛋白的含量幾乎無變化(p0.05)。3.3 TSH通過激活cAMP/PKA途徑抑制成熟脂肪細胞內ATGL的表達將3T3-L1細胞誘導分化為成熟的脂肪細胞后,進行實驗。先用10uM的H89預處理細胞1小時,然后加入2uM的bTSH;其它幾皿的細胞,則分別單獨加入2uM的bTSH、5uM的forskolin和10uM的H89,另外一皿細胞則作為空白對照組。細胞被處理24小時后,應用Western blotting方法和免疫熒光方法檢測細胞中ATGL的表達。Western blotting結果顯示：與對照組相比,bTSH處理細胞組及forskolin處理細胞組細胞內ATGL的表達均明顯受到抑制(p0.01,p0.01)；H89處理細胞組,脂肪細胞內ATGL的蛋白含量無明顯變化；同樣,用H89預處理后再用bTSH處理的細胞組,細胞內ATGL的蛋白含量較對照組也沒有明顯變化。免疫熒光結果與Western blotting結果一致,免疫熒光結果顯示：ATGL表現(xiàn)為紅色熒光,位于成熟脂肪細胞的細胞漿內,與對照組相比,bTSH及forskolin處理組細胞內ATGL的熒光亮度明顯減弱,H89處理組ATGL的熒光亮度較對照組相比無明顯變化,同樣,用H89預處理后再用bTSH處理的細胞組,細胞內ATGL的熒光亮度較對照組也沒有顯著變化。綜合上述結果說明,forskolin可以增加細胞內cAMP含量、激活PKA,從而可以抑制ATGL的表達；而當先利用H89將PKA的活性抑制后,再用TSH處理細胞,TSH與TSHR結合后無法活化PKA,從而無法發(fā)揮TSH對ATGL的抑制作用。結論：1、TSH對脂肪細胞中甘油三酯的分解代謝具有調節(jié)作用。2、TSH可以抑制小鼠成熟脂肪細胞中ATGL的表達。3、TSH通過激活cAMP/PKA通路來發(fā)揮抑制ATGL表達的作用。意義：亞臨床甲減的患病人數(shù)逐漸增加,它與許多疾病相關,但對其的診斷和治療都缺乏有力的證據(jù)；本研究豐富了TSH的甲狀腺外作用的內容,指出了其在甘油三酯代謝中發(fā)揮的部分作用,為臨床工作提供了新的思路。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R589.2

【引證文獻】

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1 秦燕;飼料中添加二氫吡啶和注射三碘甲腺原氨酸（T3）對尼羅羅非魚機體脂肪沉積及相關脂解基因表達的影響[D];華東師范大學;2017年

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本文編號：2468324