發(fā)布時(shí)間：2018-12-15 22:27

【摘要】：第一部分:細(xì)菌對(duì)家蠶中腸轉(zhuǎn)錄組的調(diào)控。天生免疫系統(tǒng)是動(dòng)物抵御入侵微生物的第一道防線,該系統(tǒng)從昆蟲到人類廣泛存在,具有很強(qiáng)的保守性。與人類中的“病從口入”一樣,大多數(shù)的致病微生物是由昆蟲口器通過取食進(jìn)入體內(nèi)的。因此,腸道首當(dāng)其沖受到細(xì)菌的侵害。但與此同時(shí),腸道可以通過物理屏障和生理反應(yīng)來阻止入侵病原物破壞腸道,并阻止病原物透過腸道進(jìn)入血淋巴。在果蠅(Drosophila melanogaster)中,腸道免疫由活性氧(reactive oxygen species,ROS)和抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)兩道防線組成,可有效地抵御入侵病原物并維持腸道內(nèi)共生菌的穩(wěn)態(tài)。作為鱗翅目昆蟲,家蠶(Bombyx mori)不僅是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲,還是一種重要的模式昆蟲,但對(duì)家蠶腸道免疫系統(tǒng)與入侵細(xì)菌之間的相互作用知之甚少。通過對(duì)家蠶腸道免疫的研究,我們期望揭示鱗翅目昆蟲腸道免疫作用機(jī)制,為蠶病的防治及鱗翅目害蟲的生物防治打下基礎(chǔ)。本研究對(duì)喂食感染黑胸?cái)⊙?Bacillus bombysepticus)和假結(jié)核耶爾森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)后的家蠶幼蟲中腸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、實(shí)時(shí)定量PCR、腸道內(nèi)ROS的測定、腸道內(nèi)細(xì)菌數(shù)目變化的統(tǒng)計(jì)以及腸道消化液抗菌活性的分析,旨在揭示家蠶腸道免疫的機(jī)制。主要結(jié)果如下:(1)通過死亡率實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌感染的前期,喂食感染黑胸?cái)⊙募倚Q死亡率高于假結(jié)核耶爾森氏菌感染的家蠶,但在細(xì)菌感染的后期,喂食感染假結(jié)核耶爾森氏菌的家蠶死亡率高于感染黑胸?cái)⊙募倚Q。(2)基于對(duì)家蠶轉(zhuǎn)錄組聚類分析和維恩圖分析,我們發(fā)現(xiàn)不同的細(xì)菌會(huì)引起家蠶中腸不同基因的轉(zhuǎn)錄變化;ROS代謝相關(guān)的基因在細(xì)菌感染的前期出現(xiàn)上調(diào)而抗菌肽基因則在細(xì)菌感染的后期出現(xiàn)上調(diào)。(3)通過Gene Ontology(GO)富集分析我們發(fā)現(xiàn)4 h和24 h時(shí)黑胸?cái)⊙腥窘M中顯著富集出來的terms明顯多于假結(jié)核耶爾森氏菌感染組中顯著富集出來的terms,48 h時(shí)假結(jié)核耶爾森氏菌感染組中顯著富集出來的terms明顯多于黑胸?cái)⊙腥窘M中顯著富集出來的terms。這一結(jié)論說明相對(duì)于陰性菌假結(jié)核耶爾森氏菌,黑胸?cái)⊙诟腥镜那捌诳梢l(fā)家蠶中腸更強(qiáng)烈的反應(yīng)。(4)通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)在黑胸?cái)⊙图俳Y(jié)核耶爾森氏菌感染的后期,家蠶腸道內(nèi)的能量代謝途徑顯著富集并上調(diào),表明家蠶在對(duì)抗腸道內(nèi)入侵的細(xì)菌時(shí)會(huì)導(dǎo)致自身大量的能量消耗。(5)實(shí)時(shí)定量PCR和腸道內(nèi)ROS的測定證實(shí)轉(zhuǎn)錄組分析得到的結(jié)論——“ROS相關(guān)的基因在細(xì)菌感染的前期出現(xiàn)上調(diào),而抗菌肽基因則在細(xì)菌感染的后期出現(xiàn)上調(diào)”。腸道內(nèi)細(xì)菌數(shù)目變化的統(tǒng)計(jì)以及腸道消化液抗菌活性的分析再次證實(shí)這一結(jié)論,表明在家蠶中腸免疫系統(tǒng)中ROS在細(xì)菌感染的初期扮演著重要的角色,而抗菌肽則主要在細(xì)菌感染的后期起作用。另外我們發(fā)現(xiàn)Toll途徑可能也參與家蠶腸道免疫反應(yīng)。結(jié)論:黑胸?cái)⊙图俳Y(jié)核耶爾森氏菌以不同的方式調(diào)控家蠶中腸轉(zhuǎn)錄組;黑胸?cái)⊙图俳Y(jié)核耶爾森氏菌感染后會(huì)引起家蠶中腸能量消耗增加;在家蠶中腸免疫系統(tǒng)中ROS在細(xì)菌感染的初期扮演著重要的角色,而抗菌肽則主要在細(xì)菌感染的后期起作用。Toll途徑可能也參與家蠶腸道免疫反應(yīng)。第二部分:家蠶肽聚糖識(shí)別蛋白PGRP-S5的功能分析。天生免疫反應(yīng)的起始由模式識(shí)別蛋白(pattern recognition proteins,PRRs)識(shí)別病原微生物表面特有的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)發(fā)動(dòng)。肽聚糖識(shí)別蛋白(peptidoglycan recognition proteins,PGRPs)是PRRs的重要成員,有些PGRPs可以識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁中的PAMP-肽聚糖(peptidoglycans,PGs)并激活昆蟲的免疫反應(yīng)抵御入侵病原物;有些PGRPs可以參與免疫反應(yīng)的調(diào)控;還有一些PGRPs可以作為效應(yīng)因子直接作用于入侵的病原物。家蠶基因組編碼12個(gè)PGRPs,前期實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)細(xì)菌感染后家蠶PGRP-S5在脂肪體、血細(xì)胞和中腸中的表達(dá)上調(diào)。為了研究PGRP-S5的功能,我們體外重組表達(dá)了家蠶PGRP-S5和其突變型C177S并進(jìn)行活性分析,并通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分析PGRP-S5的功能。主要結(jié)果如下:(1)PGRP-S5可以識(shí)別細(xì)菌PGs并激活酚氧化酶級(jí)聯(lián)反應(yīng),并且在這一激活過程中PGRP-S5的酰氨酶活性是必需的。(2)PGRP-S5依賴其酰胺酶活性通過通過IMD途徑負(fù)調(diào)控家蠶抗菌肽的合成。(3)PGRP-S5能夠結(jié)合細(xì)菌的PGs,并能引發(fā)細(xì)菌凝集。但C177位點(diǎn)不影響PGRP-S5對(duì)細(xì)菌PGs的結(jié)合和對(duì)細(xì)菌的凝集。(4)PGRP-S5具有酰氨酶活性和抗菌活性,并且其抗菌活性依賴于其酰胺酶活性,C177位點(diǎn)是PGRP-S5酰胺酶活性關(guān)鍵位點(diǎn)。結(jié)論:家蠶PGRP-S5可以作為模式識(shí)別受體引發(fā)酚氧化酶原途徑的激活,可以作為效應(yīng)因子抑制細(xì)菌的生長,并且可以依賴其酰胺酶活性通過IMD(IMmune Deficiency)途徑負(fù)調(diào)控家蠶抗菌肽合成。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q966

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本文編號(hào)：2381383