本文選題：乳腺癌 + HCCR-1�。� 參考：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景乳腺癌在女性惡性腫瘤中的發(fā)病率位居第一位。2015年全中國范圍內(nèi)預(yù)計(jì)大約有281.4萬人死于癌癥,其中死于乳腺癌的患者大約有7.07萬人,是45歲以下女性最常見的癌癥死因。近些年,隨著我國經(jīng)濟(jì)飛速發(fā)展及人口老齡化進(jìn)程的加快,乳腺癌的發(fā)病率也在逐年攀升。盡管新世紀(jì)以來乳腺癌的診療發(fā)生了日新月異的變革,我國乳腺癌患者的術(shù)后5年生存率由以往的50%左右提高至80%,歐美國家的術(shù)后5年生存率亦出現(xiàn)了上升的趨勢,但由于發(fā)病率逐年上升,仍然嚴(yán)重威脅著女性的健康。因此,早期診斷對于乳腺癌患者的預(yù)后至關(guān)重要。雖然近些年來,許多臨床醫(yī)生開展了大量的工作來篩選與乳腺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移預(yù)后相關(guān)的標(biāo)志物,并取得了一定成果,但仍未篩選出真正敏感特異的與乳腺癌癌變相關(guān)的基因。人宮頸癌基因(Human cervical cancer oncogenes, HCCRs)是從宮頸癌組織及細(xì)胞系中篩選得到的,并且發(fā)現(xiàn)其在宮頸癌及宮頸癌細(xì)胞系中高表達(dá)。HCCRs定位于人染色體的12q,編碼兩種蛋白HCCR-1和HCCR-2。目前的多項(xiàng)科研成果顯示HCCR-1與多種惡性腫瘤相關(guān),它除了在宮頸癌中高表達(dá)外,在其它腫瘤如肝癌、卵巢癌、食管癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、腎癌及白血病中亦高度表達(dá),甚至有研究表明HCCR-1可以作為肝癌及乳腺癌診斷的標(biāo)志物。在前期的研究中我們也已經(jīng)證實(shí)HCCR-1在結(jié)腸癌中高表達(dá),并且與結(jié)腸癌的生物學(xué)進(jìn)程相關(guān)。Bax (Bcl-2 associated X protein)是Oltvai等于1993年發(fā)現(xiàn)的一種與Bcl-2共沉淀的蛋白質(zhì),它與Bcl-2蛋白具有部分同源性,隸屬于Bcl-2家族,是一種重要的細(xì)胞凋亡促進(jìn)基因。它的表達(dá)產(chǎn)物與Bcl-2蛋白結(jié)合為異源二聚體,調(diào)控Bcl-2的活性,抑制了Bcl-2的抗凋亡作用,是Bcl-2家族調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵點(diǎn)。研究表明Bax蛋白往往在乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤組織中低表達(dá)。新近的報(bào)道提出,HCCR-2通過多種渠道使P53基因的活性喪失,抑制其下游基因Bax的表達(dá),并在惡性腫瘤的生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮了重要的作用,但關(guān)于HCC R-1在乳腺癌組織中的表達(dá)與細(xì)胞凋亡促進(jìn)基因Bax之間的關(guān)系目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本研究旨在通過檢測HCCR-1及Bax在人乳腺癌組織、癌旁正常組織及乳腺腺病組織中的表達(dá)差異,檢測下調(diào)HCCR-1表達(dá)對乳腺癌MCF-7細(xì)胞中Bax表達(dá)變化及對MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡的影響,分析HCC R-1及Bax的表達(dá)與人乳腺癌臨床病理學(xué)因素間的相關(guān)性,對HCCR-1及Bax表達(dá)與乳腺癌發(fā)展、侵襲以及轉(zhuǎn)移的聯(lián)系以及潛在的分子生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行初步研究。第一部分人乳腺癌組織中HCCR-1、Bax基因的表達(dá)目的：探討HCCR-1及Bax基因在乳腺癌組織、癌旁正常組織及乳腺腺病組織中的表達(dá)差異。方法：1.選取30例2014.11-2015.04在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院手術(shù)的乳腺癌患者的組織標(biāo)本制作成30對乳腺癌及癌旁正常組織的配對組織蠟塊,選取同一時(shí)期手術(shù)的30例乳腺腺病作為良性病變進(jìn)行研究；2.分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及免疫組化技術(shù)分析HCCR-1、Bax基因在30對乳腺癌、癌旁正常組織及30例乳腺腺病中的表達(dá)水平。結(jié)果：1.30對乳腺癌、癌旁正常組織及30例乳腺腺病組織中HCCR-1、Bax實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果：HCCR-1的mRNA的相對表達(dá)強(qiáng)度在乳腺癌腺組織中為1.76士0.10,高于乳腺腺病的相對表達(dá)強(qiáng)度1.092+0.201及癌旁正常組織中的相對表達(dá)強(qiáng)度1.00(P0.05);而Bax的mRNA的相對表達(dá)強(qiáng)度在乳腺癌組織中為0.57±0.08,低于乳腺腺病的相對表達(dá)強(qiáng)度1.103+0.046及癌旁正常組織中的相對表達(dá)強(qiáng)度1.00(P0.05)。2.30對乳腺癌、癌旁正常組織及30例乳腺腺病中HCCR-1、Bax免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：HCCR-1及Bax蛋白免疫組化陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞胞漿。HCCR-1在30例乳腺癌中陽性表達(dá)21例,陽性率為70.0%；在30例癌旁正常組織標(biāo)本中的陽性表達(dá)13例,陽性率為43.3%;兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=4.34,P0.05)。在30例乳腺腺病中,HCCR-1蛋白的陽性表達(dá)率為40.0%(12/30),低于乳腺癌組織的陽性表達(dá)率(χ2=5.45,P0.05),而與癌旁組織無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.07,P0.05)。Bax在30例乳腺癌中陽性表達(dá)14例,陽性率為46.7%；在30例癌旁正常組織標(biāo)本中的陽性表達(dá)23例,陽性率為76.7%；兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=7.11,P0.01)。在30例乳腺腺病中,Bax蛋白的陽性表達(dá)率為83.3%(25/30),高于乳腺癌組織的陽性表達(dá)率(χ2=8.86,P0.05),而與癌旁組織無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.42,P0.05)。第二部分下調(diào)HCCR-1表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡及Bax表達(dá)的影響目的：探討siRNA下調(diào)HCCR-1表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖、凋亡及Bax表達(dá)的影響。方法：1.將FuGENE6/HCCR-1 siRNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中。2.使用實(shí)時(shí)免疫熒光定量PCR及Western Blot技術(shù)檢測不同分組MCF-7細(xì)胞中HCCR-1及Bax表達(dá)情況變化。3.利用流式細(xì)胞儀及MTT法檢測不同分組MCF-7細(xì)胞的凋亡及增殖變化情況。結(jié)果：1.不同分組間HCCR-1 mRNA變化情況：與空白組(1.00)及對照組(1.01±0.11)相比,實(shí)驗(yàn)組的HCCR-1 mRNA表達(dá)(0.464±0.03)顯著下調(diào),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ20.05);而對照組HCCR-1 mRNA表達(dá)與空白組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。2.不同分組間HCCR-1蛋白變化情況：與空白組(0.944±0.17)及對照組(0.89±0.09)相比,實(shí)驗(yàn)組的HCCR-1蛋白表達(dá)(0.62±0.07)顯著下調(diào),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；而對照組HCCR-1蛋白表達(dá)與空白組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。3.不同分組間Bax mRNA變化情況：與空白組(1.00)及對照組(1.03±0.10)相比,實(shí)驗(yàn)組的Bax mRNA表達(dá)(4.40±0.99)顯著上升,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而對照組Bax mRNA表達(dá)與空白組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。4.不同分組間Bax蛋白變化情況：與空白組(0.69±0.11)及對照組(0.67±0.19)相比,實(shí)驗(yàn)組的Bax蛋白表達(dá)(0.95±0.22)顯著上升,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而對照組Bax蛋白表達(dá)與空白組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。5.不同分組間細(xì)胞增殖變化情況：與空白組(24h：1.244±0.05；48h：1.54±0.04;72h：1.84±0.04)及對照組(24h：1.18+0.05；48h:1.48+0.02；72h:1.81±0.02)相比,實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖在轉(zhuǎn)染后24h(0.78+0.06)、48h(1.09±0.05)、72h(1.29±0.01)均受到顯著抑制,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而空白組與對照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。6.不同分組間細(xì)胞凋亡變化情況：實(shí)驗(yàn)組凋亡率為(32.57+2.35)%,對照組凋亡率為(3.53±0.60)%,空白組凋亡率為(3.15+0.46)%,實(shí)驗(yàn)組與對照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),而對照組與空白組比較則無差異(P0.05)。第三部分HCCR-1及Bax的表達(dá)與乳腺癌臨床病理因素的相關(guān)性分析目的：為減少統(tǒng)計(jì)誤差,檢測HCCR-1、Bax在大樣本乳腺癌中的表達(dá)情況,并結(jié)合相關(guān)臨床病理資料進(jìn)行分析。方法：1.收集2012.03-2015.06期間于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院手術(shù)且資料相對完整的120例乳腺癌蠟塊,每例選取2處典型部位構(gòu)建組織芯片。2.采用免疫組化技術(shù)分析HCCR-1、Bax基因在組織芯片中的表達(dá)情況。3.結(jié)合相關(guān)臨床病理資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：1.組織芯片制作結(jié)果：共制作組織芯片蠟塊6塊,共計(jì)252點(diǎn)位,其中每個(gè)蠟塊包含空白點(diǎn)位2個(gè)。每個(gè)蠟塊勻質(zhì),內(nèi)無氣泡開裂等現(xiàn)象,微陣列排列均勻整齊、間距適中。經(jīng)免疫組化染色后的組織芯片隨機(jī)由2位病理學(xué)主治醫(yī)師判讀,存在部分位點(diǎn)脫片、移位、無效組織等現(xiàn)象。最終實(shí)際有效病例為106例。2.第一部分中30例乳腺癌病例加上組織芯片中的實(shí)際有效病例106例,共136例乳腺癌。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：在總共136例乳腺癌組織中,Bax陽性表達(dá)61例,陽性率為44.9%,HCCR-1陽性表達(dá)89例,陽性率為65.4%。兩者的陽性率相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.83,P0.05)。HCCR-1陽性表達(dá)的89例中Bax陽性表達(dá)的有25例；Bax陽性表達(dá)的61例中HCCR-1陰性表達(dá)的有36例,二者陽性表達(dá)間呈負(fù)相關(guān)性(P0.01,相關(guān)性系數(shù)γ=-0.464)。3.HCCR-1及Bax表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系：乳腺癌pTNM臨床病理分期Ⅲ-Ⅳ期中HCCR-1表達(dá)陽性率[87.5%(21/24)]高于Ⅰ-Ⅱ期中陽性率[60.7%(68/112)],呈正相關(guān)趨勢(χ2=6.27,P0.05)；隨著組織學(xué)分級的遞增HCCR-1陽性率亦逐漸升高呈正相關(guān)趨勢(χ2=6.35,P0.05)；HCCR-1在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中的陽性率[75.7%(53/70)]要高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌組織[54.5%(36/66)],呈正相關(guān)趨勢(χ2=6.73,P0.05);HCCR-1在雌激素受體陽性的乳腺癌組織中的陽性率[71.4%(70/98)]要高于雌激素受體陰性的乳腺癌組織[39.1%(9/23)],HCCR-1的過量表達(dá)與雌激素表達(dá)情況正相關(guān)(χ2=8.57,P0.05)；但HCCR-1表達(dá)與患者的年齡、腫瘤大小及孕激素表達(dá)情況無關(guān)。Bax的陽性率隨著乳腺癌腫塊大小的遞增而逐漸下降呈負(fù)相關(guān)趨勢(χ2=6.53,P0.05)；Bax在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中的陽性率[34.3%(24/70)]要低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌組織[56.1%(37/66)],呈負(fù)相關(guān)趨勢(χ2=6.51,P0.05)；但Bax表達(dá)與患者的年齡、雌孕激素表達(dá)情況、病理學(xué)pTNM分級及組織學(xué)分級無關(guān)。結(jié)論：HCCR-1在乳腺癌組織中表達(dá)高于癌旁正常組織及乳腺腺病組織,而Bax在乳腺癌組織中表達(dá)低于癌旁正常組織及乳腺腺病組織；抑制HCCR-1基因的表達(dá)對乳腺癌MCF-7細(xì)胞株的凋亡有促進(jìn)作用,而對其增殖有抑制作用,并且與Bax基因在MCF-7細(xì)胞株中的表達(dá)負(fù)相關(guān)；HCCR-1的過量表達(dá)與乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移、ER表達(dá)、組織學(xué)分級及pTNM臨床病理分級相關(guān),而與患者性年齡、PR表達(dá)及腫瘤大小無關(guān)；Bax的過量表達(dá)與乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤大小相關(guān),而與患者性年齡、ER表達(dá)、PR表達(dá)、組織學(xué)分級及pTNM臨床病理分級無關(guān)。
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本文編號：1773651