本文選題：室間隔缺損　切入點：羊水多肽組學　出處：《南京醫(yī)科大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：室間隔缺損(VSD)是心臟最常見的先天畸形之一,約占所有先天性心臟異常的40%。VSD的發(fā)生率大約為每1000名活產兒中有1.35～17.3例,先天性心臟疾病也給家庭和社會造成了沉重的經濟壓力和心理負擔。隨著分子生物學技術的發(fā)展,研究者們對心臟發(fā)育的分子機制獲得了許多重要成果。特別是一些轉錄因子(TF),例如NKX2.5、GATA4、TBX5、和HOMEZ已被確定為心臟發(fā)育過程中必不可少的。根據遺傳學中心法則,蛋白質是基因功能的最終執(zhí)行者,能顯示基因翻譯后修飾的細節(jié)。多肽組學的主要內容是研究內源性產生的蛋白質水解片段,是蛋白質組學的一個新興的分支學科。多肽組學可以呈現(xiàn)研究樣本健康狀況的動態(tài)變化,內源性多肽可以直接與靶細胞相互作用,產生功能效應。因此,心血管系統(tǒng)相關的蛋白質組學、多肽組學大大拓寬了我們對心血管系統(tǒng)復雜生理和病理狀態(tài)的認知范圍,對于迅速推進發(fā)病機制的研究有著巨大價值。近年來,隨著胎兒超聲心動圖技術水平的不斷發(fā)展、超聲儀器設備的更新?lián)Q代,人們已經可以在胎兒期和嬰兒期準確地診斷和定位室間隔缺損。以往研究報道室間隔缺損存在一定概率的自然閉合,受到調查人群、診斷標準、檢測方法、隨訪時間及室間隔缺損類型等諸多因素影響,自然閉合率波動于6%～71%。目前國內尚無大樣本量的孕期發(fā)現(xiàn)室間隔缺損產后自然閉合情況的隨訪調查。本研究第二部分旨在通過分析胎兒超聲心動圖檢查信息、嬰兒出生時信息,結合出生后轉歸情況的隨訪,評估室間隔缺損自然閉合的發(fā)生率,希望能總結出一些室間隔自然閉合的影響因素。通過統(tǒng)計學分析得出室間隔缺損自然閉合率的預測公式,給產前咨詢和預后判斷一些有實用價值的參考。第一部分室間隔缺損胎兒羊水多肽組學的分析目的：1)檢測室間隔缺損胎兒與正常對照之間羊水的內源性多肽表達譜；2)篩選與心臟發(fā)育異常相關的生物活性多肽,為后續(xù)功能研究提供基礎。方法：1) 以胎兒心臟超聲診斷為室間隔缺損的人孕23-25周羊水樣本為實驗組,孕周匹配、非疾病因素人工流產的正常胎兒羊水為對照組,采用液相色譜串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)聯(lián)合串聯(lián)質譜標記法(TMT)檢測兩組之間內源性多肽的表達情況,對原始數據去冗余后進行統(tǒng)計分析,以差異倍數1.5倍以上且變化具有統(tǒng)計學意義(P0.05)為標準,篩選出差異表達的多肽；2)分析差異表達多肽的理化性質、酶切位點、是否位于前體蛋白功能結構域之內；結合其對應前體蛋白IPA通路分析、GO分析,最終篩選出與心臟發(fā)育相關的多肽；3)滿足上述步驟篩選出心臟發(fā)育相關的多肽作為目標多肽,將對應的室間隔缺損及正常對照的母親外周血血清采用高分辨率多反應監(jiān)測體系(HR-MRM)對目標多肽進行追蹤,驗證羊水數據的可靠性及其與外周血多肽的相關性；4)依據序列保守性、組織特異性等標準,篩選出與心臟發(fā)育可能最密切相關的多肽；對篩選出的多肽進行生物信息學分析,預測潛在的酶學功能改變。結果：1)對質譜數據進行標準化處理后對比兩組結果,可以定量的多肽有692條,差異表達的多肽有183條,其中上調69條,下調114條；與心臟發(fā)育相關且位于其前體蛋白結構域內的多肽35條；2)HR-MRM母親外周血驗證結果與胎兒羊水結果發(fā)現(xiàn)有12條多肽均有表達且趨勢一致；3) 來自NOTC4的YSGPTCH和來自C05A1的PGAPLLPPLLL這兩條多肽在心臟組織/心肌細胞中特異度較高；且具有較好的物種保守性；4)生物信息學分析顯示來自NOTC4的YSGPTCH參與了Notch信號通路的組成部分,與胚胎心臟發(fā)育密切相關；且其酶切位點顯示這一差異多肽的產生與基質金屬蛋白酶-2和-9的活性改變相關。結論：1)與正常對照相比,室間隔缺損患兒羊水中的內源性多肽表達譜發(fā)生了顯著變化,提示多肽可能參與調節(jié)心臟發(fā)育的過程。2)經HR-MRM方法驗證,羊水質譜結果可靠,可用于后續(xù)分析。第二部分室間隔缺損自然愈合影響因素的研究目的：1) 通過對孕中期胎兒超聲心動圖確診為單純性室間隔缺損患兒及其母親的隨訪調查,總體描繪出江蘇地區(qū)室間隔缺損胎兒出生后的轉歸情況,找出VSD自然愈合的影響因素。2) 為產前咨詢及臨床決策提供依據,減少出生缺陷,提高人口素質；為出生后VSD患兒的預后判斷提供參考。方法：1) 2011年1月至2013年12月在胎兒超聲心動圖檢查室所有檢查出存在結構性先天性心臟病的患兒,從中篩選出單純性室間隔缺損的胎兒及母親。胎兒心臟彩超采用Acuson Sequoia 512型彩色超聲診斷系統(tǒng),配有內置數字超聲工作站。2) 超聲數據包括孕婦姓名、年齡、檢查時間孕周、聯(lián)系電話、胎心率、主肺動脈直徑、心房心室大小、房室瓣、主肺動脈瓣有無返流；室間隔缺損位置、缺損大小、缺損處分流情況。結合遺傳學檢驗結果(羊水穿刺、臍帶血穿刺),統(tǒng)計存在染色體數量及結構異常的患者。3) 隨訪問題包括目前缺損有無閉合、閉合時年齡、未閉合者治療方式、性別、出生體重、有無早產、孕期有無感染或代謝性疾病、有無心臟病家族史。4) 統(tǒng)計學方法采用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件分析：定性資料采用交叉表分析、定量資料采用ANOVA方差分析、危險因素分析采用二元logistic回歸、缺損大小與是否愈合的截斷值選擇采用ROC曲線。5) 2014年1月至3月出生的患兒隨訪后的實際結果與二元logistic回歸預測公式計算P值相比較,驗證公式的實用價值。結果：1) 初始隨訪患者共423人,有效隨訪257人,44人引產,213人出生。出生后死亡8人、存活205人。截至隨訪時,19人手術,24人未閉合,110人自然閉合(49人孕期閉合,61人產后閉合)。2) 將產后死亡、手術及未閉合的患兒歸入未閉合組,加上孕期閉合組和產后閉合組,共分為3組,比較三組間孕期B超數據及產后隨訪結果,存在統(tǒng)計學差異(P0.05)數據有：缺損直徑(3.4224-0.972,2.426±±0.599,2.292±0.479mm)、出生體重(3.095±0.774,3.1744±0.535,3.4994-0.532kg)、缺損位置、缺損處分流方向。平均閉合時間為7.31±±6.073月。以是否愈合為狀態(tài)變量,缺損直徑為檢驗變量,曲線下面積為0.842,Cut-off值：2.55mm。此時敏感度：0.800,特異度：0.718。二元logistic回歸顯示排除缺損位置影響后,出生體重為缺損愈合的保護因素,缺損直徑為缺損愈合的危險因素。3) 我們進而又根據二元logistic回歸預測概率公式P=(1+EXP-[-2.151-0.716*出生體重+1.393*直徑])-1。檢驗2014年1月至3月出生的患兒,23位患兒中19位與預測結果一致。暫無統(tǒng)計學差異的數據有母親年齡、胎兒主動脈直徑、肺動脈直徑、胎心率以及孕期母親疾病情況。結論：1) 利用統(tǒng)計學分析,找到孕中期檢查出室間隔缺損患兒出生后缺損是否可以閉合的缺損直徑截斷值為2.55mm,缺損越小越容易閉合；2) 出生體重大者自然愈合概率較高；3) 男性胎兒自然愈合的概率較高；肌部缺損愈合概率較高；缺損處未探及穿隔血流者易愈合；足月生產嬰幼兒愈合概率較高。
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【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R714.5

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