【摘要】：目的:本研究擬利用在體注射及電穿孔技術,建立FVB/N小鼠骨骼肌特異性過表達PGC-1α模型。研究方法:1.質粒轉染效率鑒定:C2C12成肌細胞進行轉染實驗,利用Flag-PGC-1α質粒進行轉染,轉染48小時后,檢測PGC-1α蛋白表達,鑒定質粒轉染效率。2.骨骼肌質粒注射后時效性觀察:雄性6-8月齡FVB/N小鼠,隨機分成3組:轉染5天組(簡稱5D),轉染10天組(簡稱10D),轉染15天組(簡稱15D),每組10只,檢測PGC-1α蛋白的表達,確定骨骼肌質粒注射后的最佳檢測時間。3.骨骼肌特異性PGC-1α過表達模型建立:雄性6-8月齡FVB/N小鼠,隨機分成3組:對照組(空載質粒注射,稱為Negative Control,簡稱NC),GFP組和Flag-PGC-1α質粒組,每組10只。Flag-PGC-1α質粒組脛骨前肌注射Flag-PGC-1α質粒(2μg/μl,40μl),并利用電穿孔法促進轉染,GFP組脛骨前肌注射GFP質粒(2μg/μl,40μl)+電穿孔法促進轉染,NC組脛骨前肌注射pUC DNA 3.1空載質粒(2μg/μl,40μl)+電穿孔法促進轉染。注射后10天,將實驗動物進行處死取材,提取脛骨前肌、心肌進行相關檢測。4.骨骼肌特異性PGC-1α過表達模型鑒定:1)組織學檢測(HE染色):分別對正常組(空白組)、NC組、Flag-PGC-1α組小鼠的脛骨前肌,進行HE染色,對其骨骼肌肌纖維進行病理學形態(tài)檢測及分析。2)Western blot法檢測脛骨前肌和心肌相關蛋白表達:PGC-1α、GFP、mtTFA、NF-κB、MnSOD、FNDC5。結果:1.Flag-PGC-1α質粒轉染C2C12成肌細胞48h后,western blot結果顯示,PGC-1α蛋白整體表達水平顯著高于對照組,提示Flag-PGC-1α質粒轉染效率較好。2.將5D、10D和15D三組小鼠脛骨前肌中PGC-1α蛋白表達量進行比較,10D組中PGC-1α蛋白表達水平最高,提示骨骼肌進行PGC-1α轉染后第10天為最佳檢測時間。3.對NC組和GFP組進行GFP蛋白表達分析,顯示GFP蛋白在GFP組表達成功,而NC組沒有表達。4.HE染色結果顯示,Flag-PGC-1α注射組的肌纖維相對于NC組有趨于愈合的趨勢。5.對實驗小鼠的脛骨前肌進行蛋白水平檢測,Flag-PGC-1α組中mtTFA蛋白表達水平相對于NC組有顯著性升高;Flag-PGC-1α組與NC組相比,FNDC5蛋白表達水平顯著性升高;NF-κB、MnSOD蛋白表達水平在各組之間沒有顯著性差異。6.對實驗小鼠的心肌進行蛋白水平檢測,與NC組相比,Flag-PGC-1α組中心肌FNDC5、mtTFA表達量顯著性升高。結論:1.成功地建立了小鼠骨骼肌特異性過表達PGC-1α模型,表現(xiàn)為骨骼肌PGC-1α表達升高,其下游線粒體轉錄相關因子、肌肉因子相關蛋白表達升高。2.骨骼肌特異性過表達PGC-1α引起心肌線粒體生物合成相關蛋白表達升高,提示可能存在骨骼肌-心肌交互作用,具體機制有待進一步研究。
【圖文】：

增強了 SIRT1 的活性。在飲食因素的作用下觀察到類似的增進行的模型實驗表明，身體活動增加了 NAD+的濃度并降低了-1α乙酰化水平[57]。兩種機制調節(jié)骨骼肌細胞外 NAD+的水平，，A致 NAD+水平升高，SIRT1 活化增強 PGC-1α的轉錄活性[58]。N酰胺轉化為 NAD+，并在訓練過程中增強骨骼肌的這一過程[59]。通過分別和一起改變 AMPK 和 NAMPT 酶的活性來調節(jié)骨骼肌的增加，伴隨著調節(jié) SIRT1 活性。但是應注意，SIRT1 的活性不其底物的濃度而且可以通過翻譯后修飾來調節(jié)。幾項研究表明，增加了酶的脫乙酰酶活性[60,61]。脫乙酰酶 SIRT1 是 PGC-1α脫乙骼肌中誘導線粒體生物發(fā)生的調節(jié)劑，可導致 PGC-1α蛋白的活RT1 基因的小鼠實驗表明，PGC-1α基因表達、蛋白質轉運、活有改變。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，代替 SIRT1，PGC-1α的脫乙酰化和蛋白質的活轉移酶催化，這種酶可能是身體活動后 PGC-1α活化的重要調節(jié)

圖 2 運動對 irisin 的調控[76]Irisin 是由 111 個氨基酸組成的可溶性 N-糖基化蛋白質激素，分子量約為 12KDa。Irisin 在進化上高度保守，小鼠和人 Irisin 序列同源性高達 100%。Irisin 與胰島素、胰高血糖素和瘦素的同源性分別為 85%、90%和 83%[2]，如下圖所示。由此提示，Irisin 可能是改善糖尿病、心衰等慢性疾病的新靶點。
【學位授予單位】：天津體育學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：G804.2

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2 李之s

本文編號：2646206