發(fā)布時間：2020-04-09 12:42

【摘要】：背景:世界衛(wèi)生組織(WHO)報告,抑郁癥占據(jù)世界疾病負擔總數(shù)的4.8%,至2030年將躍居為世界第一大負擔疾病。因此,深入揭示抑郁癥發(fā)生發(fā)展的致病機理以及發(fā)現(xiàn)抑郁癥治療的有效方法具有重要的社會、經(jīng)濟和醫(yī)學(xué)意義。晝夜節(jié)律改變導(dǎo)致的睡眠障礙和褪黑素分泌紊亂是抑郁癥的主要特征。褪黑素(melatonin,MT)主要由哺乳動物松果體分泌,具有明顯的晝夜節(jié)律。5-羥色胺(serotonin,5-HT)、5-羥色胺-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(serotonin N-acetyltransferase,SNAT)和N-乙�；�-5-羥色胺-甲基轉(zhuǎn)移酶(N-acetylserotonin methyltransferase,ASMT)是MT水平的重要調(diào)節(jié)因子。研究表明,ASMT基因多態(tài)性與抑郁癥高度相關(guān),運動則能通過調(diào)節(jié)MT及單胺類神經(jīng)遞質(zhì)等機制緩解抑郁癥狀。因此,ASMT在抑郁發(fā)病機制以及運動干預(yù)中的作用值得進一步研究。目的:探究ASMT基因敲除是否導(dǎo)致小鼠的抑郁行為,并揭示運動對大腦神經(jīng)可塑性的作用和機制,以期為運動干預(yù)抑郁癥的機制研究以及抑郁癥的臨床研究提供新的靶點。方法:本實驗選用雌性純合子ASMT基因敲除小鼠15只,同窩野生型小鼠14只(背景均為C57BL/6小鼠),6-7周齡,體重24-25g。根據(jù)小鼠基因型分成四組,每組7-8只:(1)WT組(n=7),即野生控制組,正常飼養(yǎng),不施加任何干預(yù);(2)WE組(n=7),即野生運動組,實驗小鼠6-7周齡時開始接受5周的游泳訓(xùn)練;(3)KO組(n=8),即基因敲除組,鑒定為ASMT基因敲除小鼠后,正常飼養(yǎng),不施加任何干預(yù);(4)KE組(n=7),即敲除運動組,ASMT基因敲除小鼠6-7周齡時開始接受5周的游泳訓(xùn)練。5周的運動干預(yù)后,各組小鼠接受抑郁行為學(xué)檢測,行為學(xué)檢測結(jié)束后,將小鼠麻醉取血和海馬組織。檢測血清5-HT、MT、去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)的含量;采用電鏡檢測海馬CA1區(qū)突觸結(jié)構(gòu)與數(shù)量;采用免疫熒光技術(shù)檢測海馬CA1區(qū)和齒狀回區(qū)的神經(jīng)元特異性核蛋白(neuron-specific nuclear protein,NeuN)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、突觸蛋白(synapsin,SYP)、生長相關(guān)蛋白-43(growth-associated protein-43,GAP-43)等神經(jīng)可塑性標志蛋白表達情況。結(jié)果:1抑郁行為學(xué)實驗結(jié)果顯示,與WT組相比,KO組在糖水實驗(SPT)中的糖水消耗量顯著降低(P0.05),在強迫游泳實驗(FST)中的不動時間顯著增加(P0.05),掙扎時間非常顯著減少(P0.01)在開場實驗(OFT)中的中央路程顯著減少(P0.05);與KO組相比,KE組在SPT中的糖水消耗量顯著升高(P0.05)。2血清酶聯(lián)免疫吸附實驗結(jié)果顯示,與WT組相比,KO組的MT血清含量下降但未達到顯著性差異,去甲腎上腺素(NE)的血清含量顯著上升(P0.05);與KO組相比,KE組的MT含量上升,但未達到顯著性差異,5-HT含量顯著增加(P0.05)。3電鏡實驗結(jié)果顯示,與WT組相比,KO組海馬CA1區(qū)PSD厚度顯著下降(P0.05),而突觸間隙的寬度非常顯著升高(P0.01),突觸數(shù)量顯著下降(P0.05)。與KO組相比,KE組海馬CA1區(qū)PSD厚度非常顯著升高(P0.01),突觸間隙寬度下降,但未達到顯著性差異。4免疫熒光實驗結(jié)果顯示,與WT組相比,KO組在海馬CA1v區(qū)NeuN表達顯著下降(P0.05),在CA1d區(qū)GFAP表達顯著升高(P0.05),在DG區(qū)GAP-43表達非常顯著降低(P0.01),NeuN表達顯著升高(P0.05),GFAP表達顯著升高,WE組在海馬CA1d區(qū)GFAP表達顯著下降(P0.05)。與KO組相比,KE組在海馬CA1v區(qū)GAP-43表達顯著升高(P0.05),GFAP表達顯著升高(P0.05),在CA1d區(qū)NeuN表達顯著升高(P0.05),GFAP表達非常顯著下降(P0.01),在GD區(qū)GAP-43表達顯著升高(P0.05),NeuN表達顯著下降(P0.05),GFAP表達顯著下降(P0.05)。結(jié)論:(1)ASMT基因敲除可誘發(fā)小鼠抑郁行為,游泳運動對此有明顯改善作用,且這種改善作用可能與血清MT和5-HT的水平有關(guān)。(2)ASMT基因敲除會使小鼠海馬CA1區(qū)突觸結(jié)構(gòu)造成破壞,突觸數(shù)量減少,游泳運動能一定程度上逆轉(zhuǎn)突觸結(jié)構(gòu)上的改變。(3)ASMT基因敲除可總體下調(diào)GAP-43、NeuN、SYP,上調(diào)GFAP在海馬CA1v、CA1d區(qū)與DG區(qū)的表達,游泳運動可一定程度上逆轉(zhuǎn)這些變化,卻進一步上調(diào)了CA1v區(qū)GFAP的表達。意義:本研究采用ASMT基因敲除小鼠作為動物模型,探討了ASMT基因敲除導(dǎo)致的褪黑素分泌障礙是否會誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抑郁行為,是對抑郁動物模型的新探索;其次以大腦神經(jīng)可塑性作為切入點對ASMT基因敲除小鼠進行研究,探究運動干預(yù)作用對小鼠抑郁行為的影響極其機制,為運動抗抑郁作用提供更堅實的佐證。
【圖文】：

華東師范大學(xué) 2019 屆碩士學(xué)位論文9圖1-1. 晝夜節(jié)律變化對血清褪黑素濃度以及大腦神經(jīng)可塑性的影響Figure 1-1. Influence of circadian rhythm changes on serum melatonin concentration and brainneuroplasticity[106].2 材料與方法2.1 實驗動物及分組由仁源生物技術(shù)（上海）有限公司采用 CRISPR 技術(shù)構(gòu)建 ASMT 全身性因敲除小鼠，與野生型小鼠（背景均為 C57BL/6）并進行繁殖。待小鼠 3-4 周齡，體重 17-20g 時對同窩小鼠按性別分籠，打耳釘進行標記并將小鼠尾巴末端剪去 2mm 左右樣本進行基因鑒定。此時進行標記、取材與分籠是因為小鼠達到斷奶周齡，可以進食飼料，同時防止小鼠進一步成熟后發(fā)生交配行為；分籠與取材一次性完成也可減少對小鼠傷害的次數(shù)。通過基因鑒定最終選取 F3 代雌性性純合子 ASMT 基因敲除小鼠 15 只，F(xiàn)3 代同窩野生型小鼠 14 只。隨后所有小鼠還需進行適應(yīng)性飼養(yǎng) 3 周，至小鼠體重達到 24-25g。

實驗處理流程圖
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：G804.2

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本文編號：2620769