【摘要】：研究背景:我國是世界上高原面積最大、海拔最高、居住人口最多的國家,海拔3000 m以上的高原、高山地區(qū)占我國國土總面積的1/4,主要分布在西藏、青海和新疆一帶。這些地區(qū)是國家實施西部大開發(fā)戰(zhàn)略的重要戰(zhàn)場,隨著青藏鐵路的開通、高原地區(qū)國民經濟的發(fā)展和旅游事業(yè)的興旺,進入高原的人群成倍增長。高原地區(qū)的大氣壓、氧分壓、溫度、濕度等都不同于平原地區(qū),這些因素的改變對機體造成的影響是廣泛的,包括對心血管系統(tǒng)、神經系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等多方面的影響。在這些影響因素中低氧是最主要的影響因素,以往的研究多集中于高原低氧對急進高原人群及久居高原人群身體機能的影響,而對于反復進入高原后又返回平原,從事高原運輸、高原旅游等人群的實驗研究較少。間歇性低氧(intermittent hypoxia,IH)是指機體或組織間斷處于低氧環(huán)境。研究表明,間歇性低氧對機體組織的影響取決于低氧的程度、低氧的持續(xù)時間、以及低氧-常氧交替方式。膽堿,作為B族維生素中的一種重要的水溶性營養(yǎng)物質,在許多生理過程中如信號轉導、生物合成及保持細胞膜的完整性中起重要作用。研究表明,低氧暴露可以改變膽堿代謝。但膽堿對低氧損傷的影響尚不清楚。研究目的:本文擬從整體水平和細胞水平研究間歇低氧對氧化應激和內皮功能的影響,并探討其作用機制,為高原疾病防治研究提供理論依據;觀察膽堿在血管內皮細胞低氧損傷中的作用,為進一步探究其作為抗低氧損傷的藥物提供參考。研究方法:1.間歇低氧對大鼠氧化應激和內皮功能的影響選取48只雄性Wistar大鼠,體重180~200g,隨機分為常氧組和低氧組,每組各24只。常氧組在正常情況下飼養(yǎng),低氧組大鼠于低壓氧艙中接受模擬6000米海拔高度、15℃的低壓低氧處理,每天8小時,其余時間在正常情況下飼養(yǎng)。實驗進行7d、14d、21d、28d后,常氧組和低氧組分別各取6只大鼠,取材后測定大鼠血清、心肌組織、腦組織、肝組織、腎組織中MDA含量、SOD和T-AOC水平研究其氧化應激變化,以及檢測血清NO和ET含量、VEGF的表達觀察內皮功能的變化。2.間歇低氧對血管內皮細胞氧化應激和內皮功能的影響采用主動脈血管片貼壁培養(yǎng)法,體外培養(yǎng)雄性Wistar大鼠主動脈血管內皮細胞,分別設置對照組,間歇低氧組:對照組:21%O2,37℃,48h;間歇低氧27h組:低氧(1%O2,37℃)27h,再復氧(21%O2,37℃)21h;間歇低氧30h組:低氧(1%O2,37℃)30h,再復氧(21%O2,37℃)18h。分別在低氧和復氧結束后收集對照組和間歇低氧組細胞上清,檢測MDA、SOD、NO、ET水平變化。另設置正常對照組、不同濃度H202組、低氧組及低氧復合H202組研究氧化應激對血管內皮細胞的損傷作用。3.膽堿抗低氧損傷的內皮細胞保護作用體外培養(yǎng)雄性Wistar大鼠主動脈血管內皮細胞,分別設置對照組(21%O2,37℃)、低氧組(1%O2,37℃)、膽堿組、膽堿+拮抗劑組,檢測細胞存活率、細胞培養(yǎng)液中LDH的釋放及VEGF的表達。研究結果:1.慢性間歇性低氧對大鼠氧化應激和內皮功能的影響(1)慢性間歇性低氧對大鼠氧化應激的影響血清:間歇低氧1、2、3周后,與對照組相比,低氧組大鼠血清MDA無顯著性變化;而間歇低氧4周后,與對照組相比,低氧組大鼠血清MDA水平顯著升高(P0.05);間歇低氧前3周,對照組與低氧組大鼠血清SOD水平無顯著性差異。間歇低氧4周后,與對照組相比,低氧組大鼠血清SOD水平顯著降低(P0.01);T-AOC水平在不同時間間歇低氧干預后均升高,并于第2、3、4周出現顯著性差異(P0.01)。心肌組織:與對照組相比,心肌組織MDA含量在大鼠間歇低氧1、2、3、4周后均出現顯著性升高(P0.01);SOD水平在不同低氧時間干預后均降低,且在第2、4周后出現顯著性降低(P0.05);T-AOC水平也在各周后出現降低趨勢。腦組織:與對照組相比,腦組織MDA含量在大鼠間歇低氧1、2、3、4周后均有降低趨勢,且第4周后出現顯著性差異(P0.05);SOD在不同低氧時間干預后均降低,且在第2周后出現顯著性降低(P0.05);T-AOC在各周后出現不同程度的升高,但無統(tǒng)計學意義。肝組織:與對照組相比,肝組織MDA含量在大鼠間歇低氧1、3、4周后均降低,且第4周后出現顯著性差異(P0.05);SOD在不同低氧時間干預后均出現降低趨勢,但無顯著性差異;T-AOC在各周后出現不同程度的降低,且在第3、4周后出現極顯著性差異(P0.01)。腎組織:與對照組相比,肝組織MDA含量在大鼠間歇低氧各周后均有升高趨勢,且在第4周后出現顯著性差異(P0.05);SOD在間歇低氧干預各周后出現降低趨勢;T-AOC在各周后出現升高趨勢,但各組間無顯著性差異。(2)慢性間歇性低氧對大鼠內皮功能的影響與對照組相比,大鼠血清NO含量在第2周后開始降低,且第2周和第4周有顯著性差異(P0.05);血清ET在不同時間間歇低氧干預后均有降低趨勢,且在第2周后出現顯著性差異(P0.05);血清VEGF的表達在第1、2、4周后均有降低趨勢,但并無統(tǒng)計學意義。2.間歇性低氧對血管內皮細胞氧化應激和內皮功能的影響(1)間歇性低氧對血管內皮細胞氧化應激的影響間歇低氧27h組,與對照組相比,低氧和復氧后血管內皮細胞MDA水平均無顯著性差異;間歇低氧30h組,與對照組相比,復氧18h后間歇低氧組血管內皮細胞MDA水平顯著升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。因此,我們選擇低氧30h、復氧18h研究間歇低氧對血管內皮細胞的影響。間歇低氧30h組細胞在復氧結束后SOD水平有降低趨勢,但并不具有統(tǒng)計學意義。不同濃度H2O2干預6h、12h、24h、27h后,各組細胞存活率并無顯著性差異。而干預30h后,與對照組相比,800μmol/L H2O2濃度組細胞存活率顯著下降(P0.01),LDH的釋放顯著升高(P0.01)。與對照組相比,低氧組、H2O2組和低氧復合H2O2組細胞存活率顯著下降(P0.05),H2O2組、復合組LDH的釋放顯著升高(P0.01)。(2)間歇性低氧對血管內皮細胞內皮功能的影響與對照組相比,低氧結束后,間歇低氧組血管內皮細胞NO水平顯著降低,ET水平顯著升高(P0.05);而經過18h的復氧,低氧組NO的釋放顯著升高,同時ET的釋放顯著降低(P0.01).3.膽堿抗低氧損傷的內皮細胞保護作用常氧條件下,膽堿處理大鼠主動脈內皮細胞24-48h,細胞存活率升高,而LDH沒有顯著差異(P0.05);低氧條件下,膽堿處理內皮細胞24-48h,0.1-10μmol/L使大鼠主動脈內皮細胞細胞存活率升高,而降低LDH水平(P0.05)。低氧24h后內皮細胞分泌的VEGF顯著升高(P0.05),10μmol/L膽堿能夠進一步增加內皮細胞分泌VEGF(P0.01);低氧條件下,與膽堿孵育組相比,拮抗劑MLA組的細胞存活率顯著下降(P0.01)。結論:1.慢性間歇性低氧暴露(模擬海拔6000m,8h/d)不同時間后可以使大鼠氧化應激系統(tǒng)激活,血清、心肌組織、腦組織、肝組織、腎組織氧化應激程度不同,呈現各自特征性改變。慢性間歇性低氧可以使大鼠內皮功能受到影響,其中一個顯著性變化就是NO生成減少。ET水平在間歇低氧的作用下也發(fā)生變化,VEGF水平沒有顯著性改變,提示慢性間歇性低氧對血管內皮的通透性影響較小。2.間歇低氧(1%O2,37℃,30h,再21%O2,37℃,18h)可以使內皮細胞產生氧化應激損傷。不同程度的氧化應激對細胞的損傷程度不同。本實驗中,800μmol/LH2O2干預30h血管內皮細胞損傷最嚴重。低氧復合氧化應激比單獨任一因素對細胞的損傷都大。間歇低氧可能對低氧所致的血管內皮細胞功能損傷有所修復。3.正常和低氧條件下,膽堿均有促大鼠主動脈內皮細胞增殖的作用,且膽堿對血管內皮細胞的低氧損傷有保護作用,其作用機制可能與促進VEGF分泌相關。膽堿可能是通過激活α7 n Ach R這一靶點促進主動脈內皮細胞增殖的。
【學位授予單位】：天津體育學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：G804.2

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本文編號：2548419