本文關(guān)鍵詞：有氧運(yùn)動(dòng)改善阿爾茨海默病大鼠認(rèn)知功能損害的中樞免疫機(jī)制的研究

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【摘要】：目的:阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種復(fù)雜的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,并且發(fā)病率與年齡呈正相關(guān)。學(xué)習(xí)記憶能力減退和認(rèn)知功能下降是AD主要的臨床表現(xiàn)。AD典型的病理特征有以β淀粉樣蛋白(Amyloid protein,Aβ)過(guò)度沉積形成的老年斑和tau蛋白過(guò)度磷酸化所造成的神經(jīng)纖維纏結(jié)。其中,Aβ的神經(jīng)毒性作用已經(jīng)得到了廣泛的認(rèn)可,Aβ的大量沉積不僅能夠引發(fā)神經(jīng)元的凋亡,并且可以通過(guò)激活膠質(zhì)細(xì)胞從而引起腦內(nèi)炎癥反應(yīng)。而腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)反過(guò)來(lái)也能促使Aβ進(jìn)一步表達(dá),從而造成病理狀態(tài)下的惡性循環(huán)。目前關(guān)于AD的發(fā)病機(jī)制還不能確定,沒(méi)有一種假說(shuō)可以全面的闡述AD,并且有效治療AD的藥物和手段還沒(méi)有出現(xiàn)。所以對(duì)于AD的早期預(yù)防則顯得尤其重要。有氧運(yùn)動(dòng)不僅僅是一種良好的鍛煉方式而且對(duì)大腦的發(fā)育起到非常有益的作用。越來(lái)越多的研究證實(shí),有氧運(yùn)動(dòng)可以增強(qiáng)腦功能、促進(jìn)神經(jīng)元的再生和抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,并對(duì)學(xué)習(xí)記憶有著重要的改善作用。有研究表明,有氧運(yùn)動(dòng)可以減少Aβ的產(chǎn)生和炎癥因子的釋放,但是關(guān)于有氧運(yùn)動(dòng)和AD的研究尚處于早期階段,并且具體的作用機(jī)制還不明確。因此本實(shí)驗(yàn)將從行為學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)技術(shù)兩個(gè)方向出發(fā),觀(guān)察有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)Aβ誘導(dǎo)的AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善。同時(shí)通過(guò)對(duì)外周血炎癥因子及與mapk信號(hào)通路相關(guān)蛋白的測(cè)定,來(lái)觀(guān)察有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)aβ誘導(dǎo)的機(jī)體炎癥反應(yīng)是否能夠產(chǎn)生抑制作用。本研究旨在為有氧運(yùn)動(dòng)作為防治ad的手段提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ),同時(shí)為延緩ad的發(fā)病進(jìn)程,降低ad的發(fā)病率提供新的思路。方法:雄性sd大鼠2月齡,體重200±20g,隨機(jī)分為對(duì)照組(control)、運(yùn)動(dòng)組(running)、ad模型組(aβ1-42)和運(yùn)動(dòng)治療組(aβ1-42/running)。四組大鼠全部進(jìn)行埋管手術(shù)。其中對(duì)照組和ad模型組正常飼養(yǎng),不進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練。待大鼠完成手術(shù)恢復(fù)后,運(yùn)動(dòng)組和運(yùn)動(dòng)治療組同時(shí)進(jìn)行為期四周的有氧運(yùn)動(dòng)跑臺(tái)訓(xùn)練,大鼠每周訓(xùn)練5天,休息2天,跑臺(tái)的坡度為0°。兩組大鼠在前兩周均以10m/min的速度跑2個(gè)15min,每隔15min休息5min,第3周以15m/min的速度跑3個(gè)15min,每隔15min休息5min,第4周以15m/min的速度跑4個(gè)15min,每隔15min休息5min。前兩周的有氧訓(xùn)練結(jié)束后,每天向?qū)φ战M和運(yùn)動(dòng)組大鼠套管中注射與aβ1-42同等體積的生理鹽水,為期兩周;每天向ad模型組和運(yùn)動(dòng)治療組大鼠側(cè)腦室注射250pmol的aβ1-42,為期兩周,建立大鼠的ad模型。模型建立完成后,采用morris水迷宮實(shí)驗(yàn)(morriswatermaze,mwm)觀(guān)察各組大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力的改變。然后采用分子生物學(xué)技術(shù)分析:①酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠外周血液中炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfatctor-alpha,tnf-α)和白介素1β(interleukin1beta,il-1β)的表達(dá)含量;②免疫蛋白印記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mapk信號(hào)通路上特定蛋白:c-jun氨基末端激酶(c-junn-terminalkinase,jnk)、p38mapk分裂原激活的蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase,p38)和erk細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinases,erk)的磷酸化水平以及總蛋白表達(dá)變化。數(shù)據(jù)按照均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±sem)表示。運(yùn)用sigmaplot11.0軟件對(duì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并作圖,p0.05表示有顯著性差異,p0.01表示有非常顯著性差異。結(jié)果:1、①morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,伴隨著大鼠游泳天數(shù)的遞增,各組大鼠尋找水下隱藏平臺(tái)的潛伏期與游泳總距離也出現(xiàn)顯著減少。從大鼠游泳訓(xùn)練第1~5天,通過(guò)aβ建立的ad模型組大鼠與對(duì)照組相比,尋找水下隱藏平臺(tái)的潛伏期和游泳總距離均出現(xiàn)顯著增加(p0.01),表明ad模型組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力減退。對(duì)比ad模型組與運(yùn)動(dòng)治療組發(fā)現(xiàn),在第1~5天,運(yùn)動(dòng)治療組的逃避潛伏期明顯低于ad模型組(p0.05)。在第1~4天,運(yùn)動(dòng)治療組的游泳總距離顯著低于ad模型組(p0.05)。說(shuō)明有氧運(yùn)動(dòng)可以改善aβ誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶功能損害,并具有保護(hù)作用。②把隱藏平臺(tái)去除,進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ad模型組在原隱藏平臺(tái)所在象限的游泳時(shí)間與總游泳時(shí)間的百分比與對(duì)照組相比出現(xiàn)顯著的下降(p0.01)。并且ad模型組大鼠在原隱藏平臺(tái)所在象限的游泳距離與總距離的百分比與對(duì)照組相比也出現(xiàn)顯著的下降(p0.01),說(shuō)明aβ組的大鼠表現(xiàn)出了顯著的空間記憶障礙。而單純的有氧運(yùn)動(dòng)組與對(duì)照相比不論從時(shí)間百分比還是距離百分比上,其在原平臺(tái)象限的活動(dòng)百分比均未出現(xiàn)顯著性差異(p0.05),說(shuō)明單純的有氧運(yùn)動(dòng)并不能直接增強(qiáng)海馬依賴(lài)的空間參考記憶的鞏固。而運(yùn)動(dòng)治療組大鼠無(wú)論是時(shí)間還是距離上所占的百分比與ad模型組相比都出現(xiàn)顯著性提高(p0.01)。這一結(jié)果表明,aβ可以誘導(dǎo)大鼠空間參考記憶的丟失,而有氧運(yùn)動(dòng)能夠改善這一損傷。③可視平臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,將平臺(tái)露出水面1~2cm,各組大鼠找到平臺(tái)所用的時(shí)間無(wú)顯著性差異(p0.05),各組大鼠的游泳速度也無(wú)顯著性差異(p0.05)。從而排除了大鼠視力及其運(yùn)動(dòng)能力對(duì)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。2、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,通過(guò)檢測(cè)大鼠外周血中tnf-α和il-1β的表達(dá)含量發(fā)現(xiàn),單純的有氧運(yùn)動(dòng)組與空白對(duì)照組中tnf-α或是il-1β這兩種炎性因子并未出現(xiàn)顯著性差異(tnf-α,p=0.746;il-1β,p=0.883),這一結(jié)果說(shuō)明單純的有氧運(yùn)動(dòng)并不能對(duì)外周血中的炎癥因子造成任何影響。ad模型組大鼠與對(duì)照組相比外周血中tnf-α與il-1β的含量明顯增多(p0.01)。而運(yùn)動(dòng)治療組的兩種炎性因子的含量均顯著低于ad模型組(p0.05)。這一結(jié)果表示,aβ影響了機(jī)體的免疫功能從而導(dǎo)致了外周炎癥因子在外周血中的表達(dá)含量升高,而有氧運(yùn)動(dòng)能夠緩解aβ誘導(dǎo)的外周血液炎癥因子表達(dá)的上調(diào)。3、通過(guò)westernblot免疫蛋白印跡的方法測(cè)定mapk信號(hào)通路相關(guān)蛋白:erk蛋白,p38mapk蛋白和jnk蛋白的磷酸化水平以及總蛋白表達(dá)變化。①對(duì)erk蛋白測(cè)定后發(fā)現(xiàn),ad模型組erk蛋白磷酸化水平與總erk蛋白的比值與對(duì)照組相比出現(xiàn)非常顯著的下降(p0.01)。而運(yùn)動(dòng)治療組erk蛋白的磷酸化水平與ad模型組相比出現(xiàn)顯著的上升(p0.05),說(shuō)明了aβ引發(fā)erk蛋白活性的抑制,而有氧運(yùn)動(dòng)阻止了aβ引起的erk蛋白活性抑制。通過(guò)erk總蛋白與β-actin的對(duì)比我們發(fā)現(xiàn)各組的總蛋白水平并沒(méi)有顯著的改變(p0.05),說(shuō)明aβ和有氧運(yùn)動(dòng)都是通過(guò)erk的磷酸化對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行調(diào)控并未影響到erk總蛋白的表達(dá)。②對(duì)p38mapk蛋白測(cè)定后發(fā)現(xiàn),ad模型組的p38蛋白磷酸化水平與總p38蛋白的比值與對(duì)照組相比顯著上升(p0.05)。運(yùn)動(dòng)治療組磷酸化p38蛋白的水平與ad模型組相比出現(xiàn)非常顯著的下降(p0.01),說(shuō)明了aβ引起p38蛋白的激活,而有氧運(yùn)動(dòng)阻止了p38蛋白的過(guò)度激活。通過(guò)p38總蛋白與β-actin的對(duì)比我們發(fā)現(xiàn)各組的總蛋白水平并沒(méi)有顯著的改變(p0.05),說(shuō)明aβ和有氧運(yùn)動(dòng)都是通過(guò)p38的磷酸化對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行調(diào)控并未影響到p38總蛋白的表達(dá)。③對(duì)jnk蛋白測(cè)定后發(fā)現(xiàn),ad模型組jnk蛋白的磷酸化水平與對(duì)照組相比出現(xiàn)非常顯著的升高(p0.01)。運(yùn)動(dòng)治療組jnk磷酸化水平與ad模型組相比顯著下降(p0.05)。然而我們發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)治療組與對(duì)照組相比jnk磷酸化水平仍有非常顯著的升高(p0.01),說(shuō)明了aβ引起jnk蛋白的激活,而有氧運(yùn)動(dòng)阻止了jnk蛋白的過(guò)度激活。通過(guò)jnk總蛋白與β-actin的對(duì)比我們發(fā)現(xiàn)各組的總蛋白水平并沒(méi)有顯著的改變(p0.05),說(shuō)明aβ和有氧運(yùn)動(dòng)都是通過(guò)jnk的磷酸化對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行調(diào)控并未影響到j(luò)nk總蛋白的表達(dá)。結(jié)論:aβ能夠引起ad模型組大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力出現(xiàn)明顯的損傷,而有氧運(yùn)動(dòng)則可以很好的改善這種損傷。aβ能夠引起外周血液中tnf-α和il-1β這兩種炎癥因子的含量升高,而有氧運(yùn)動(dòng)可以降低這兩種炎癥因子的表達(dá)含量。而炎癥因子的表達(dá)升高必然伴隨腦內(nèi)炎癥相關(guān)信號(hào)p38/jnk蛋白的表達(dá)升高,從而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷以及認(rèn)知功能障礙。aβ引起的大鼠空間認(rèn)知功能損傷的機(jī)制可能是由P38/JNK兩種信號(hào)因子的過(guò)度磷酸化和ERK磷酸化水平的降低造成的,而有氧運(yùn)動(dòng)可以改善Aβ引起的P38/JNK兩種信號(hào)因子的過(guò)度磷酸化,同時(shí)也阻止了ERK磷酸化水平的降低。說(shuō)明有氧運(yùn)動(dòng)能夠通過(guò)調(diào)節(jié)不同MAPK類(lèi)激酶來(lái)改善Aβ引起的炎癥反應(yīng),起到神經(jīng)保護(hù)作用以及改善認(rèn)知功能的作用。
【學(xué)位授予單位】：太原理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：G804.2

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