目的:利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)建立S1PR5基因敲除的小鼠模型,為研究鞘氨醇-1-磷酸受體5（sphingosine-1-phosphate receptor 5,S1PR5）在異基因造血干細(xì)胞移植中的作用提供實(shí)驗(yàn)工具。方法:根據(jù)S1PR5基因第三外顯子堿基序列,設(shè)計(jì)針對(duì)S1PR5基因的sgRNA（single guide RNA）,構(gòu)建sgRNA表達(dá)質(zhì)粒,利用T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄sgRNA和Cas9后,將Cas9 mRNA和sgRNA對(duì)C57BL/6小鼠的受精卵進(jìn)行顯微注射。使用T7E1酶切和或基因測(cè)序檢測(cè)S1PR5基因堿基的突變情況,然后應(yīng)用q PCR和Western blot方法檢檢測(cè)S1PR5是否被成功敲除。結(jié)果:獲得了2種S1PR5基因突變的F2代純合子小鼠,即基因分別缺失170 bp和215 bp的S1PR5-170/-170小鼠和S1PR5-215/-215小鼠。在這兩種小鼠中,S1PR5在mRNA和蛋白水平均沒(méi)有表達(dá)。結(jié)論:成功建立了S1PR5基因敲除的小鼠模型,為探討S1PR5在異基因造血干細(xì)胞移植的作用提供了研究平臺(tái)。 

【文章頁(yè)數(shù)】：8 頁(yè)

【文章目錄】：
材料和方法
    質(zhì)粒構(gòu)建
    體外轉(zhuǎn)錄和Cas9 mRNA/sgRNA的顯微注射
    小鼠基因組DNA提取,PCR擴(kuò)增及T7E1酶切檢測(cè)突變
    S1PR5表達(dá)的q PCR及Wstern blot檢測(cè)
    S1PR5-/-小鼠NK細(xì)胞功能的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)
結(jié)果
    sgRNA的設(shè)計(jì)、打靶載體構(gòu)建及受精卵顯微注射
    PCR和測(cè)序驗(yàn)證F0代首建鼠
    PCR和測(cè)序驗(yàn)證F1代小鼠
    F2代純合子小鼠的驗(yàn)證
    F2代純合子小鼠NK細(xì)胞的功能
討論



本文編號(hào)：3713916