研究目的:構建可表達TACO基因特異性si RNA的慢病毒干涉載體,在此基礎上探討TACO對巨噬細胞清除胞內結核分枝桿菌的影響及相關機制,為后續(xù)活體內靶向性抗Mtb感染的研究提供方向和基礎。研究方法:1.根據(jù)TACO基因的m RNA序列選擇3條靶序列,遵照si RNA設計原則設計相應的sh RNA,同時設計一條堿基序列被隨機打亂的序列作為對照sh RNA序列。針對各sh RNA分別設計一對單鏈寡聚脫氧核苷酸,經退火形成相應sh RNA表達的雙鏈DNA片段,再通過切分子克隆的方法將其插入sh RNA慢病毒表達框架質粒p Sico R,獲取四個重組慢病毒表達載體p Sico R-TACO-si RNA。經酶切及測序鑒定無誤后,將其分別命名為p SRT1-4,其中p SRT4為含對照sh RNA表達序列的慢病毒表達質粒。2.將重組慢病毒干涉載體（p SRT1-4）同膜蛋白質粒p MD2G與慢病毒包裝質粒p SPAX2按一定比例混合包裝病毒顆粒,收集可表達相應sh RNA的病毒顆粒（分別命名為LV-p SRT1-4）。收集的慢病毒顆粒采用超濾離心管濃縮法進行病毒顆粒的濃縮,再用逐孔倍比稀釋法感... 

【文章來源】：南昌大學江西省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

-1TACO-siRNA序列經退火后雙鏈合成

第 2 章 TACO 慢病毒干涉載體的構建及鑒定2.2 結果2.2.1 TACO 特異性 shRNA 慢病毒表達載體構建成功設計合成的taco-siRNA上下游表達序列片段退火后合成的DNA序列經瓊脂糖凝膠電泳后顯示在 100bp 處出現(xiàn)相應片段，提示已經成功形成雙鏈 DNA（圖2-2-1），再將重組質粒 PSRT1/2/3/4 與原始質粒 pSicoR 經 XhoⅠ和 XbaⅠ雙酶切鑒定后，在 300~400bp 處出現(xiàn)相應片段，且重組質粒 PSRT1/2/3/4 相比原始質粒 pSicoR 的片段要略大，與理論預測相符（圖 2-2-2）。將 PSRT1/2/3/4 送至測序結果表明，重組質粒的 taco-siRNA 片段已經全部正確插入相應載體開放讀碼框的正確位點，與設計的 taco-shRNA 序列進行對比分析無突變。（圖 2-2-3）

19圖 2-2-3 PSRT1、PSRT2、PSRT3、PSRT4 測序波峰圖2.2.2 慢病毒包裝、滴度檢測及感染將 PSRT1/2/3/4 以及 pSicoR 質粒在 293T 細胞中進行慢病毒包裝，在完成包裝 24h 后，置于熒光倒置顯微鏡下觀察，可檢測到 PSRT1/2/3/4 以及 pSicoR 質粒中 GFP 蛋白表達后發(fā)出的綠色熒光，其細胞熒光率可達 90%以上（圖 2-2-4）。將包裝 72h 后病毒液收集濃縮，經倍比稀釋后感染 96 孔的 293T 細胞進行滴度檢測。在感染后的第 3 天觀察熒光計數(shù)后根據(jù)公式計算，其結果見（表 2-2-1）。其病毒滴度均在 1×108TU/ML 以上，符合轉染所需病毒滴度。將濃縮后的病毒


本文編號：3458919