【摘要】：放射治療是腫瘤治療的三大重要手段之一,大約有60-70%的腫瘤患者在治療的不同階段需要進(jìn)行放射治療,世界衛(wèi)生組織在1992年報(bào)告,45%的惡性腫瘤可以治愈,其中,手術(shù)貢獻(xiàn)22%、放療貢獻(xiàn)18%、化療5%,充分體現(xiàn)放射治療在腫瘤治療中的地位。隨著適形放療、調(diào)強(qiáng)放療及影像引導(dǎo)調(diào)強(qiáng)放療(IGRT)等精確放療設(shè)備的廣泛應(yīng)用,以及質(zhì)子、重離子等新型電離射線在臨床的不斷應(yīng)用,放射治療在腫瘤治療的作用進(jìn)一步得到提高。但在臨床放療實(shí)踐中,廣大放療工作者也觀察到部分患者在治療中,并沒(méi)有取得良好的治療效果,或者是初始放射治療中,腫瘤得到良好的控制,獲得明顯的影像及臨床療效,但就是在很短的時(shí)間內(nèi),患者腫瘤又出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,而且腫瘤的再程治療往往非常困難,效果不佳,最終影響腫瘤放療的最終療效。腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移成為臨床工作的難點(diǎn),其機(jī)制的研究成為臨床與基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。目前,腫瘤生物學(xué)研究認(rèn)為,惡性腫瘤轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的重要原因是由于腫瘤干細(xì)胞的存在。腫瘤干細(xì)胞的重要特征之一是放化療抵抗,其中,腫瘤干細(xì)胞特殊的基因表達(dá)譜及分子生物學(xué)功能是其特異生物學(xué)行為的重要原因,這些特殊相關(guān)基因被稱為干性相關(guān)基因,這些干性相關(guān)基因的輻射抵抗機(jī)制是腫瘤放射生物學(xué)的重要內(nèi)容。參與輻射抵抗作用的干性相關(guān)基因有哪些,這些干性相關(guān)基因的作用機(jī)制如何目前仍不清楚。本研究擬通過(guò)根治性放療宮頸癌為研究對(duì)象,應(yīng)用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選出放療抵抗干性相關(guān)基因,并對(duì)感興趣干性相關(guān)基因進(jìn)行相關(guān)輻射抵抗分子機(jī)制研究以及臨床預(yù)后確證。一方面將為臨床腫瘤放療患者預(yù)后療效判斷提供重要參考指標(biāo),為臨床個(gè)體化放療提供依據(jù),另一方面通過(guò)對(duì)相關(guān)分子靶點(diǎn)的研究,將能尋找到臨床提高放療療效的有效手段,為提高腫瘤放療療效指出有效的治療措施。研究方法1、選取放療至50Gy時(shí)腫瘤仍明顯殘留的根治性放療宮頸癌患者3例,分別獲取放療50Gy仍殘留及放療前的腫瘤組織,通過(guò)基因表達(dá)譜芯片篩選出放療前后差異表達(dá)基因。2、應(yīng)用熒光定量PCR對(duì)部分基因進(jìn)行驗(yàn)證以保證芯片結(jié)果的可靠性并篩選出感興趣干性相關(guān)基因CXCL12與CD44。3、通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)130例根治性放療宮頸癌患者的CXCL12和CD44的表達(dá),分析其表達(dá)的臨床預(yù)后判斷價(jià)值。4、設(shè)計(jì)3條CXCL12的siRNA序列轉(zhuǎn)染Hela宮頸癌細(xì)胞,抑制Hela細(xì)胞CXCL12-2-的表達(dá),elisa法、實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr檢測(cè)cxcl12表達(dá)變化,并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)cd44和cxcr4表達(dá)的影響。5、應(yīng)用sirna方法抑制hela細(xì)胞cxcl12的表達(dá)結(jié)合不同劑量照射,應(yīng)用cck8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性,流式細(xì)胞儀pi雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,,elisa法、實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr檢測(cè)cxcl12表達(dá)變化,并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)cd44和cxcr4的影響。研究結(jié)果1、基因表達(dá)譜芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn),上調(diào)表達(dá)3倍以上的基因有111個(gè),下調(diào)表達(dá)3倍以上基因有127個(gè),其中cxcl12表達(dá)上調(diào)34.37倍,cd44表達(dá)上調(diào)3.40倍,熒光定量pcr證實(shí)芯片結(jié)果可靠。2、免疫組化結(jié)果顯示,cxcl12陽(yáng)性表達(dá)主要定位于腫瘤細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì),cd44陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜,在根治性宮頸癌中,cxcl12或cd44的表達(dá)與患者年齡、figo分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分型、腫瘤大小、治療方案情況無(wú)明顯相關(guān)性;log-rank生存分析及多因素生存分析均發(fā)現(xiàn):宮頸癌figo分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、cxcl12表達(dá)、cxcl12和cd44共表達(dá)是獨(dú)立的生存預(yù)后因素,log-rank生存分析cd44是預(yù)后的影響因素,但多因素分析cd44未有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在130例宮頸癌患者中,cxcl12和cd44表達(dá)具有顯著相關(guān)性(p=0.028);cxcl12表達(dá)陰性的5年生存率為50.6%,陽(yáng)性的僅為30.0%,cd44表達(dá)陰性的5年生存率為42.3%,陽(yáng)性的僅為33.4%,其有34例患者存在cxcl12和cd44共表達(dá),通過(guò)生存生析,這34例宮頸癌患者的5年生存率顯著降低,僅為22.9%,剩余患者的5年生存率為44.5%(p=0.005)。3、通過(guò)熒光定量rt-pcr檢測(cè)cxcl12mrna,結(jié)果顯示si-rna1、si-rna2、si-rna3的mrna相關(guān)表達(dá)量分別為0.69±0.16、0.27±0.05、0.50±0.12。elisa檢測(cè)cxcl12蛋白表達(dá)的影響,cxcl12蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為:si-rna1(0.62±0.04)、si-rna2(0.33±0.04)、si-rna3(0.52±0.05),無(wú)論是mrna還是蛋白表達(dá),si-rna2抑制效果最明顯(p0.05)。4、si-rna2轉(zhuǎn)染hela細(xì)胞48h后,利用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)cd44和cxcr4蛋白表達(dá)變化,結(jié)果顯示,見(jiàn)圖2,si-rna組cd44蛋白表達(dá)量為0.69±0.01,明顯小于空白對(duì)照組(1.00±0.02)及陰性對(duì)照組(1.02±0.03)。si-rna組cxcr4蛋白表達(dá)量為1.41±0.08,明顯小于空白對(duì)照組(1.00±0.01)及陰性對(duì)照組(0.96±0.03)。5、與單純照射組相比,沉默cxcl12聯(lián)合照射抑制hela細(xì)胞的增殖的同時(shí),促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。cck8法:細(xì)胞存活率從單純4gy照射的79%降低到62%,從單純8gy照射的59%下降至44%。流式細(xì)胞儀的annexin-v/pi雙染法:單純4gy照射的細(xì)胞凋亡率為21%升高至SiRNA+4Gy的凋亡率為27.96%,單純8Gy照射的細(xì)胞凋亡率為39%升高至SiRNA+8Gy的51%。6、與單純照射組,沉默CXCL12聯(lián)合照射可抑制Hela細(xì)胞CD44的蛋白表達(dá),促使CXCR4的蛋白表達(dá)。流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)蛋白表達(dá),結(jié)果顯示:4Gy照射組中,單純照射組的CD44蛋白表達(dá)量(1.55±0.02)下降至Si RNA組的1.33±0.02,而單純照射組的CXCR4蛋白表達(dá)量(1.13±0.02)上升至Si RNA組(1.40±0.01);8Gy照射組中,單純照射組的CD44蛋白表達(dá)量((1.85±0.02)下降至Si RNA組的1.40±0.01。單純照射組的CXCR4蛋白表達(dá)量(1.27±0.02)上升至Si RNA組(1.48±0.02)。結(jié)論1、表達(dá)譜芯片篩選到與宮頸癌放療抵抗相關(guān)基因238個(gè),其中上調(diào)基因有111個(gè),下調(diào)基因有127個(gè);干性相關(guān)基因CXCL12表達(dá)上調(diào)34.37倍,CD44表達(dá)上調(diào)3.40倍。2、CXCL12與CD44在宮頸癌中表達(dá)具有相關(guān)性,CXCL4和CD44是根治性放療宮頸癌患者的重要預(yù)后不良因素。3、沉默CXCL12可通過(guò)阻止細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡來(lái)增加宮頸癌細(xì)胞的輻射敏感性。4、CXCL12至少部分通過(guò)介導(dǎo)CD44陽(yáng)性宮頸癌干細(xì)胞微環(huán)境來(lái)促進(jìn)放療抵抗。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.33;R730.55
【圖文】：

同時(shí)進(jìn)行樣品的瓊脂凝膠電泳結(jié)果（圖 2）表明，28S RNA(48(1900bp)條帶仍是挺清楚，5S RNA(120bp) 處條帶不太清楚，表明 不明顯，盡管有部分降解，但其純度及完整性均能滿足后續(xù)芯片實(shí)

3.4 表達(dá)譜芯片箱線圖和散點(diǎn)圖表達(dá)譜單熒光芯片的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)均一化和對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換以后繪制箱線圖（Box-Whisker plot），用于評(píng)估芯片雜交數(shù)據(jù)的分布和分散程度（圖3a），表明放療前后的樣品分樣基本對(duì)稱，在生物學(xué)性質(zhì)上的可比性。將單熒光芯片樣品數(shù)據(jù)兩兩比較的散點(diǎn)圖列陣?yán)L制成散點(diǎn)圖（matrix plot），見(jiàn)圖4b，散點(diǎn)圖中每一個(gè)點(diǎn)代表芯片上的探針點(diǎn)，表明樣品間的數(shù)據(jù)總體分布集中趨勢(shì)。圖4 芯片箱線圖和散點(diǎn)圖Fig.4 Expression chip box and scatter charts通過(guò)對(duì)芯片進(jìn)行初步分層聚類分析，具體見(jiàn)圖5，橫軸表示時(shí)間，縱軸表示不同基因

本文編號(hào)：2731887