【摘要】：研究背景與目的中國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(CHINET)從2005年到2013年連續(xù)八年對全國各地臨床分離菌株進行耐藥性檢測,分析結果表明,革蘭陰性桿菌為我國大型教學醫(yī)院主要的臨床分離菌株(約占70%),分離率有升高趨勢,從2005年為66.9%至2010年的71.6%,在2013年升至73.0%。其中腸桿菌科耐碳青霉烯藥物比例從2005年0%~3%升至2013年的7%,非發(fā)酵菌耐碳青霉烯藥物比例從2005年30%升至2013年的60%。革蘭陰性菌中最常見的菌株分別為大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌。二十世紀八十年代以來,由于廣譜抗菌藥物的濫用,革蘭陰性桿菌的耐藥狀況日趨嚴重。基于碳青霉烯類藥物對革蘭陰性桿菌具有穩(wěn)定的抗菌效果,臨床將其作為對革蘭陰性桿菌感染治療的重要手段。然而,近年來,對碳青霉烯藥物耐藥細菌的報道越來越多。因此,加強對此類細菌耐藥性的研究、監(jiān)測、遏制耐碳青霉烯類藥物菌株的產生與傳播,成為微生物領域的研究熱點。耐碳青霉烯類藥物革蘭陰性桿菌常常為多重耐藥/泛耐藥菌株,攜帶并有效表達耐藥基因,是此類菌株產生耐藥的分子機制,產生水解酶,通道蛋白改變,外排泵過表達,青霉素結合蛋白改變等,是細菌對藥物產生耐藥性的關鍵機制。目前用于治療此類菌株感染的抗菌藥物主要為β內酰胺類藥物,包括青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類藥物等。菌株對這些藥物的耐藥常常涉及一種或多種機制。鑒于臨床治療實際需要及檢測試驗可操作性等原因,明確此類菌株的耐藥表型,是當前研究的主要內容之一。根據(jù)體外藥物敏感試驗結果,分析臨床分離菌株對各類藥物的耐藥特征,可有效反映分離菌株耐藥性的地域性差異,對于指導當?shù)嘏R床醫(yī)生合理抗菌治療具有重要的實踐價值。對于碳青霉烯類藥物而言,產生碳青霉烯酶是細菌耐藥的主要機制。目前,國內外針對此類菌株的研究,多著力于碳青霉烯酶在不同菌株中的分布差異,以及在不同地域的流行分布特征。根據(jù)Ambler分子結構分類,可將碳青霉烯酶分為3組,分別為A、B、D三類酶,A類、D類為絲氨酸酶,B類為金屬beta內酰胺酶。B類酶中又以NDM-1型酶最為常見,在世界多個國家和地區(qū)均有報道,并且blaNDM的變異基因正在逐漸發(fā)現(xiàn)并報道(包括NDM-1到NDM-14)。研究表明,亞型之間雖然僅有個別氨基酸的置換,但其耐藥性有所不同。此外,從生物信息學的角度來看,不同型別的碳青霉烯酶受到抗菌藥物長期作用,有著各自相對穩(wěn)定的進化關系。明確本地區(qū)所流行碳青霉烯酶的種類,以及不同菌株中攜帶酶的類型差異,分析流行型別在進化關系樹中的位置,預測其下一步可能的突變進化方向,對指導本地區(qū)抗感染治療,具有重要意義。基于耐碳青霉烯革蘭陰性桿菌的廣泛耐藥活性,此類菌株在院內感染中占據(jù)著重要地位,而院內感染又是此類菌株擴散及其耐藥性在菌株間傳播的重要方式。因此,對臨床分離菌株進行克隆株分型研究,明確是否存在耐碳青霉烯藥物菌株,以及該菌株是否有院內感染流行趨勢,可為臨床經驗治療提供合理指導外,對于院內感染的防控亦具有重要價值。為解決上述問題,我們設計了本課題,旨在通過檢測臨床分離耐碳青霉烯革蘭陰性桿菌,分析其耐藥表型,探究碳青霉烯耐藥基因的存在與分布,明確是否有院內感染的存在,為臨床抗感染治療及流行病學研究,提供可靠的實驗室依據(jù)。研究方法(1)菌株收集收集鄭州大學第一附屬醫(yī)院檢驗科細菌室2013年7月到2013年12月份間,臨床分離來自河南不同地區(qū)的不同標本來源的耐亞胺培南/美羅培南非重復革蘭陰性桿菌121株,其中大腸埃希菌10株,肺炎克雷伯菌19株,銅綠假單胞菌30株和鮑曼不動桿菌62株所有菌株均經過Vitek 2 Compact鑒定到種。(2)細菌耐藥性及流行病學分析采用WHOnet5.0分析軟件,對所有分離菌株流行分布特征及耐藥表型進行統(tǒng)計分析。藥物敏感試驗質控菌株采用大腸埃希菌ATCC 25922。(3)全基因組DNA采用DNA提取試劑盒提取。嚴格按照說明書要求規(guī)范操作。(4)耐碳青霉烯菌株初篩首先用改良Hodge實驗和EDTA協(xié)同抑制實驗對碳青霉烯酶進行表型篩選,改良Hodge實驗以待測株和陽性對照株在抑菌圈與劃線交叉處有增強生長現(xiàn)象為篩選陽性。EDTA協(xié)同實驗以靠近EDTA紙片處有抑菌環(huán)擴大為陽性篩選。(5)耐碳青霉烯菌株確證對于初篩陽性菌株,提取全基因組DNA后,采用PCR技術對A類(KPC)、B類(NDM,VIM,SPM,IMP,GIM)和D類酶基因(OXA23,OXA24,OXA51,OXA58)擴增,并對擴增產物進行測序分析,測序結果Blast比對明確型別。(6)分子進化預測分析NDM酶所有變異體結構及氨基酸序列差異,使用軟件分析藥物正選擇位點并模擬變異體酶蛋白三維結構,進行NDM變異體同源性分析。(7)菌株分型研究采用RAPD-PCR方法對銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌進行隨機引物擴增,依據(jù)擴增結果對菌株進行同源性分析。研究結果1碳青霉烯酶檢出情況檢出A類KPC陽性11株,其中肺炎克雷伯菌10株,大腸埃希菌1株,檢出B類NDM陽性7株,其中肺炎克雷伯菌3株,大腸埃希菌4株,其中有兩株檢測出NDM-5(國內僅兩例報道)。對銅綠假單胞菌的碳青霉烯酶基因擴增,結果均為陰性,鮑曼不動桿菌對D類酶基因擴增,60株鮑曼均為OXA23,OXA51陽性,其中一株鮑曼不動OXA24陽性,一株OXA58陽性。2金屬酶NDM變異體本研究通過對PCR陽性標本的測序中發(fā)現(xiàn)了blaNDM-5,發(fā)現(xiàn)時國內尚無報道,僅在國際上有幾例報道。blaNDM-5相比于blaNDM-1為88位與154位發(fā)生氨基酸置換。3菌株分型情況根據(jù)RAPD-PCR菌株分型技術聯(lián)合瓊脂糖凝膠電泳,將銅綠假單胞菌分為14型,鮑曼不動桿菌分為4型。結論(1)腸桿菌科碳青霉烯酶基因分離率高,占62%,產生碳青霉烯酶是腸桿菌科耐碳青霉烯藥物的主要機制。其中在兩株大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)blaNDM-1變異基因blaNDM-5,并且耐藥性不同。耐藥基因通過單個核苷酸的突變產生新的耐藥基因型。(2)在銅綠假單胞菌中未發(fā)現(xiàn)碳青霉烯酶基因,并且對通道蛋白基因檢測均為陰性,可推測此地銅綠假單胞菌耐碳青霉烯藥物機制以通道蛋白缺失為主。(3)銅綠假單胞菌的RAPD-PCR結果,分為14型,鮑曼不動桿菌分型結果為4型,其中一型占88.7%,銅綠假單胞菌主要以散發(fā)為主,鮑曼不動桿菌有明顯優(yōu)勢克隆株,應加強監(jiān)測,防止優(yōu)勢克隆株的流行。
【圖文】：

改良Hodge實驗

株細菌攜帶 KPC 基因，，其中肺炎克雷伯菌 10 株，大腸埃希菌 1 株，PCR 結果見圖 2-2，PCR 產物經上海生工生物工程公司測序，并與 GenBank 比對，確定為 KPC-2 型基因，部分測序結果如圖 2-3 所示，不同顏色代表不同堿基，單峰代表純合堿基。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R446.5

【參考文獻】

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1 汪復;;2005中國CHINET細菌耐藥性監(jiān)測結果[J];中國感染與化療雜志;2006年05期

2 胡付品;朱德妹;汪復;俞云松;林潔;胡云建;艾效曼;胡志東;李金;徐元宏;沈繼錄;張泓;孔菁;張朝霞;季萍;王傳清;王愛敏;倪語星;孫景勇;孫自鏞;陳中舉;卓超;蘇丹虹;徐英春;張小江;魏蓮花;吳玲;單斌;杜艷;陳佰義;儲云卓;;2012年中國CHINET碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌的分布特點和耐藥性分析[J];中國感染與化療雜志;2014年05期

本文編號：2602028