【摘要】：近年來,微流控芯片上的數(shù)字PCR方法得到了長足的發(fā)展。數(shù)字PCR技術以其超高的靈敏度、準確度和絕對定量的性質也引起人們的強烈關注。數(shù)字PCR技術與微流控芯片相得益彰,互相促進,如集成流路數(shù)字PCR芯片、滑動芯片、百萬像素數(shù)字PCR芯片和多種液滴數(shù)字PCR芯片。然而,這些現(xiàn)有的數(shù)字PCR芯片或者配有較多的管路或者配有復雜的外加設備,操作費時費力。并且,現(xiàn)有的幾款已經商業(yè)化的數(shù)字PCR儀器價格昂貴,并且完全依賴進口,限制了數(shù)字PCR技術在我國生命科學研究領域的普及。另外,微流控芯片的集成化是一大的發(fā)展趨勢,將樣品處理、富集、分離純化、反應等功能元件通過某種方式集成到一張芯片上,使其協(xié)同發(fā)生作用,力求實現(xiàn)真正的sample-in/answer-out。本文在總結了數(shù)字PCR技術的原理、發(fā)展和應用的基礎上,結合了本實驗室的實際情況,取得了如下的創(chuàng)新結果：1)、利用PDMS的透氣性并結合了濾器的過濾原理,我們設計并研制了一種基于PDMS透氣性的薄膜數(shù)字PCR芯片。該芯片包括如同濾器結構的μfilter結構和如同濾膜的薄膜芯片。其中的μfilter結構有兩部分組成,其上有進樣孔和抽氣孔,能實現(xiàn)一端抽氣,一端進樣。薄膜芯片如同濾膜被夾于μfilter中間,其上有650個直徑0.2 mm,深0.23 mm的圓形小室。當連接μfilter的注射器抽動時,薄膜芯片的一側出現(xiàn)了低于大氣壓的負壓,被樣品封閉的空氣會慢慢透過PDMS薄膜進入到注射器中,最終將液體試劑帶入到每個小室中并充滿。充滿樣品的薄膜芯片可以在PCR儀上進行數(shù)字PCR反應。2)、PDMS的透氣性雖然方便了進樣,但在PCR的反應熱循環(huán)中也引起了水分的蒸發(fā),影響了反應。我們沒有進行特殊處理,而是在薄膜芯片外增加一片面積較大的補水層,抑制了蒸發(fā)帶來的危害,取得了很好的效果。3)、我們通過分步進樣的方法,將核酸提取元件與數(shù)字PCR元件集成起來。首先將核酸提取的所需的試劑分段存放在特氟龍管中,當我們在核酸提取元件的一端抽動注射器時,特氟龍管的試劑依次經過核酸提取區(qū),樣品裂解液中的磁珠被核酸提取區(qū)的磁鐵吸附下來,洗滌試劑依次通過核酸提取區(qū)完成對磁珠的清洗,PCR試劑將純化核酸從磁珠上洗脫下來。由于負壓操作,核酸提取中的樣品裂解液和洗滌液無法進入到PCR反應區(qū)中,防止了污染的發(fā)生。4)、我們發(fā)展了基于PDMS透氣性的進樣方法,在微流控芯片的數(shù)字PCR小室旁放置一個面積較大的抽氣層實現(xiàn)負壓進樣。當連接抽氣層的注射器抽動的時候,抽氣層內部呈現(xiàn)負壓,芯片小室中的氣體透過PDMS進入到抽氣層中,并將試劑帶入并充滿每個小室。同時,抽氣層待進完樣之后,又被充入水分起到了防蒸發(fā)的作用。我們同時將核酸提取元件集成到此數(shù)字PCR芯片上,實現(xiàn)了在一張芯片上進行核酸提取和數(shù)字PCR反應。綜上所述,基于PDMS的透氣性,我們研制了一種可以利用注射器提供的負壓就能實現(xiàn)樣品進樣,并能完成數(shù)字PCR反應的微流控芯片。該數(shù)字PCR系統(tǒng)比現(xiàn)有的數(shù)字PCR平臺更加簡便、易操作、實用性好。我們還通過分步進樣的方法實現(xiàn)了核酸提取元件與數(shù)字PCR反應元件在微流控芯片上的集成,并成功的進行了牛肉DNA的提取和數(shù)字PCR檢測。其特點是操作方便快速、試劑消耗少,準確性好,適于普通實驗室使用。并且該芯片還可利用到基于磁珠方法的RNA提取,細胞捕獲等方面,為生命科學領域的更關鍵問題如腫瘤診斷、單細胞檢測、稀有細胞捕獲和檢測提供了一種新的方法和儀器。
[Abstract]:In recent years, the digital PCR method on the micro-fluidic chip has been developed. The high sensitivity, accuracy and absolute quantitative properties of the digital PCR technology also give rise to the strong interest of people. The digital PCR technology is complementary to the micro-fluidic chip, and is mutually promoted, such as an integrated flow path digital PCR chip, a sliding chip, a million pixel digital PCR chip and a plurality of liquid drop digital PCR chips. However, these existing digital PCR chips, or with more lines or with complex external equipment, are laborious and time-consuming. Moreover, the existing several commercial digital PCR instruments are expensive and rely on the import completely, limiting the popularization of the digital PCR technology in the field of life science research in China. In addition, the integration of the micro-fluidic chip is a major development trend, and the functional elements such as sample processing, enrichment, separation and purification, reaction and the like are integrated into a single chip in a certain way, so that the micro-fluidic chip can cooperate with each other, and the real sample-in/ answer-out can be realized. Based on the summary of the principle, development and application of the digital PCR technology, this paper, combined with the actual situation of the laboratory, has obtained the following innovative results:1), using the air permeability of PDMS and combining the filter principle of the filter, We designed and developed a film digital PCR chip based on PDMS air permeability. The chip includes a mufilter structure like a filter structure and a thin film chip like a filter membrane. Wherein, the filter structure is composed of two parts, a sample injection hole and an air extraction hole are arranged on the filter structure, one end of the filter structure can be pumped, and one end of the sample is injected. The membrane chip is clamped in the middle of the. filter with a filter membrane with 650 circular cells with a diameter of 0.2 mm and a depth of 0.23 mm. When the syringe connected to the. mufilter is pumped, a negative pressure below atmospheric pressure appears on one side of the film wafer, and the air trapped by the sample is slowly introduced into the syringe through the PDMS film, and finally the liquid reagent is brought into each chamber and is filled. The membrane chip filled with the sample can carry out the digital PCR reaction on the PCR instrument.2) The air permeability of the PDMS is convenient for injection, but also the evaporation of the water is caused in the reaction thermal cycle of the PCR, and the reaction is influenced. We do not carry out special treatment, but add a large area of water-supplementing layer outside the film chip, which can inhibit the damage caused by evaporation.3) We integrate the nucleic acid extracting element and the digital PCR element through the method of separating the step-like sample. firstly, the required reagent segments of the nucleic acid extraction are stored in a Teflon tube; when we pump the syringe at one end of the nucleic acid extraction element, the reagent of the Teflon tube passes through the nucleic acid extraction region in sequence, the magnetic beads in the sample cracking liquid are absorbed by the magnet of the nucleic acid extraction region, The washing reagent sequentially performs the cleaning on the magnetic beads through the nucleic acid extraction region, and the PCR reagent is used for eluting the purified nucleic acid from the magnetic beads. As a result of the negative pressure operation, the sample lysing liquid and the washing liquid in the nucleic acid extraction cannot enter the PCR reaction zone to prevent the occurrence of the pollution. And a large area of the air extraction layer is arranged beside the digital PCR chamber of the micro-fluidic chip to realize the negative pressure injection. When the syringe connected to the suction layer is withdrawn, a negative pressure is present inside the suction layer, and the gas in the wafer chamber is introduced into the suction layer through the PDMS, and the reagent is brought into and filled with each cell. At the same time, after the air extraction layer is finished, the air is filled with water to act as an anti-evaporation function. At the same time, the nucleic acid extracting element is integrated on the digital PCR chip, and the nucleic acid extraction and the digital PCR reaction on a single chip are realized. To sum up, based on the air permeability of PDMS, we have developed a micro-fluidic chip which can realize the sample injection by using the negative pressure provided by the syringe, and can complete the digital PCR reaction. Compared with the prior digital PCR platform, the digital PCR system is more convenient, easy to operate and good in practicability. The integration of the nucleic acid extraction element and the digital PCR reaction element on the microfluidic chip is also realized by a step-by-step method, and the extraction of the beef DNA and the detection of the digital PCR are successfully carried out. The method is characterized in that the operation is convenient and rapid, the reagent consumption is small, the accuracy is good, and the method is suitable for common laboratory use. And the chip can also be used in the aspects of RNA extraction and cell capture based on the magnetic bead method, and provides a new method and an instrument for the more important problems in the field of life science such as tumor diagnosis, single cell detection, rare cell capture and detection.
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R440

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本文編號：2439407