【摘要】：目的:本實驗旨在觀察經(jīng)抗凋亡基因(Bcl-2)修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)移植對缺血性心功能不全家兔心肌細胞調(diào)亡、血管新生及心功能的影響,并探討其可能機制。方法:BMSCs分離、培養(yǎng)及純化:采用骨髓穿刺法獲取含BMSCs的兔骨髓液,在體外經(jīng)密度梯度離心+貼壁培養(yǎng)法,獲取足量、純化的BMSCs。重組腺病毒載體的構(gòu)建:用酶切法將目的基因(Bcl-2)從原始質(zhì)粒上切下,并與p Shuttle-CMV-EGFP重組穿梭載體連接,然后將p Shuttle-CMV-EGFP-Bcl-2基因片段連接到p Adeno載體上,獲得含Bcl-2的重組腺病毒載體質(zhì)粒。用重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞,收集病毒并大量擴增,經(jīng)反復凍融后置于-80℃保存待用。轉(zhuǎn)染細胞前,將重組腺病毒液解凍、復蘇并進行滴度測定。細胞轉(zhuǎn)染:選取生長狀態(tài)良好的BMSCs,采用含有增強型綠色熒光蛋白(EGFP)標記的腺病毒及重組Bcl-2-腺病毒分別轉(zhuǎn)染上述細胞。模型制備及細胞移植:將28只新西蘭兔隨機分為以下3組:MI+BMSCs+Bcl-2組、MI+BMSCs組和MI+DMEM組,分別結(jié)扎左冠狀動脈前降支制作心肌梗死模型。2周后經(jīng)心臟超聲篩查,將造模成功(心功能不全標準為:LVEF≤50%)的各組家兔于心肌梗死邊緣區(qū)分別注射等量的腺病毒-Bcl-2轉(zhuǎn)染的BMSCs(MI+BMSCs+Bcl-2組)、腺病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs(MI+BMSCs組)及DMEM液(MI+DMEM組)。指標觀察:細胞移植后4周再次經(jīng)超聲測定心功能:左室射血分數(shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)、左室舒張末內(nèi)徑(LVEDD)及左室收縮末內(nèi)徑(LVESD);切取正常及梗死邊緣區(qū)心肌組織,制作石蠟及冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察移植細胞的存活及分布;采用蘇木精-伊紅(H-E)染色法評估心肌病理學改變;原位缺口末端標記法(TUNEL)檢測心肌凋亡細胞數(shù)并計算凋亡率;免疫組化染色檢測CD31的表達,計算新生毛細血管密度;RT-PCR檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因表達。并分別與心功能(LVEF)進行相關(guān)性分析。結(jié)果:1 BMSCs分離及培養(yǎng)情況:骨髓液經(jīng)Percoll分離液密度梯度離心后,可見乳白色絮狀物層,經(jīng)反復換液及貼壁培養(yǎng)后獲得純化的BMSCs,24-48h后觀察到散在貼壁的紡錘狀BMSCs,7-10d時BMSCs呈長梭狀,細胞間形成突起,胞核居中,細胞排列疏松,18-21d可見形態(tài)規(guī)則的單層融合束狀貼壁細胞,排列緊密呈漩渦狀、放射狀。經(jīng)胰蛋白酶消化融合的BMSCs,以1:2比例進行傳代培養(yǎng),24h后細胞完全貼壁,3-5d后即達80%融合。傳至第10代時細胞生長速度逐漸減慢;2本實驗成功構(gòu)建出大量重組腺病毒載體,凍存的病毒液經(jīng)連續(xù)梯度稀釋后分別感染293細胞,經(jīng)觀察細胞病變率,計算病毒最終滴度(T)為2.5×1010PFU/ml;3轉(zhuǎn)染后細胞狀態(tài):選用生長狀態(tài)良好的第九代BMSCs,經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染24-48h后,于熒光顯微鏡下觀察到帶有綠色熒光蛋白標記(EGFP)的BMSCs,細胞排列整齊,形態(tài)均一呈長梭狀,經(jīng)預實驗測定MOI值為500時轉(zhuǎn)染效率最佳。4模型建立及動物存活情況:28只新西蘭兔接受造模手術(shù),術(shù)后共有24只存活,經(jīng)超聲學驗證其LVEF均≤50%。其中MI+BMSCs+Bcl-2組存活8只,死亡1只;MI+BMSCs組存活8只,死亡2只;MI+DMEM組存活8只,死亡1只。共死亡4只,2只于結(jié)扎前降支過程中誘發(fā)室顫死亡,1只造模后呼吸驟停死亡,1只于二次開胸細胞移植后48h死亡。5熒光顯微鏡下觀察細胞存活情況:B M S C s移植后4周,M I+BMSCs+Bcl-2組及MI+BMSCs組在熒光顯微鏡下均可觀察到綠色熒光,MI+DMEM組無綠色熒光。6普通光鏡下觀察心肌病理學變化:正常心肌細胞形態(tài)均一、排列整齊。細胞質(zhì)染色均勻,呈淡藍色,胞核大小一致,呈橢圓形或圓形,居胞質(zhì)中央。梗死邊緣區(qū)的心肌細胞排列紊亂,心肌纖維部分斷裂,細胞間可見多種炎性細胞浸潤。梗死區(qū)正常心肌細胞形態(tài)消失,代之以成纖維細胞及粗大的膠原纖維束,排列較疏松,其間未見炎性細胞浸潤。各組梗死邊緣區(qū)心肌組織與正常心肌組織比較可發(fā)現(xiàn):MI+BMSCs+Bcl-2組病理學改變較輕微,MI+BMSCs組其次,MI+DMEM組較嚴重。7心肌梗死邊緣區(qū)細胞凋亡率、新生血管密度及VEGF m RNA表達量:MI+BMSCs+Bcl-2組及MI+BMSCs組凋亡率均較MI+DMEM組降低,其中前者降低更為顯著[(30.75±5.65)%,(44.14±5.99)%,(63.38±8.52)%,F=46.00,P0.05];MI+BMSCs+Bcl-2組毛細血管密度及VEGF基因表達量(RQ值)均明顯高于MI+BMSCs組,后組又明顯高于MI+DMEM組(毛細血管密度:24.25±3.46,14.38±2.92,6.88±2.03,F=74.07,P0.05;RQ:1.64±0.29,0.99±0.17,0.64±0.19,F=40.56,P0.05)。8細胞移植4周后經(jīng)超聲檢測各組心功能:與MI+DMEM組相比,MI+BMSCs+Bcl-2組和MI+BMSCs組的LVEF及LVFS均明顯升高,LVEDD及LVESD均明顯降低,其中MI+BMSCs+Bcl-2組變化更為顯著;[LVEF:(66.63±2.67)%,(60.50±3.16)%,(55.25±2.60)%,F=32.532,P0.05;LVFS:(40.50±1.60)%,(34.63±2.33)%,(27.25±2.05)%,F=86.736,P0.05;LVEDD:(10.13±0.64)mm,(12.07±0.59)mm,(13.93±0.51)mm,F=85.225,P0.05;LVESD:(6.61±0.35)mm,(7.02±0.26)mm,(8.20±0.49)mm,F=37.697,P0.05]。9相關(guān)性分析結(jié)果:LVEF與心肌細胞的凋亡率呈負相關(guān)(r=-0.769,P0.01,Y=76.091-0.36X);與毛細血管密度及VEGF m RNA的表達量呈正相關(guān)(r=0.85,P0.01,Y=47.726+0.776X;r=0.741,P0.01,Y=47.484+11.047X)。結(jié)論:經(jīng)Bcl-2基因修飾的BMSCs移植可較單純BMSCs移植更顯著地減少心肌細胞凋亡、促進血管新生、改善心功能,其作用機制可能與Bcl-2基因的抗凋亡作用及BMSCs旁分泌作用下微循環(huán)的改善有關(guān)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R457.7

【參考文獻】

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本文編號：2348447